薛東齊，許向陽，姜景彬，柴鑫鳳，張　紅，李景富

（1.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院番茄研究所，哈爾濱　150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱　150030）

番茄葉霉病抗性基因Cf-5、Cf-9和Cf-12介導的抗性生理研究

薛東齊1，許向陽1，姜景彬1，柴鑫鳳2，張紅1，李景富1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院番茄研究所，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱150030）

為明確番茄葉霉病抗性基因Cf-5、Cf-9和Cf-12介導的過敏反應中抗性生理間差異，為Cf-0（CK）、Cf-5、Cf-9、Cf-12番茄材料接種葉霉菌生理小種1.2.3，并比較各抗性材料在活性氧暴發(fā)、H2O2積累、水楊酸含量及超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶、多分氧化酶活性變化等相關生理生化指標異。結果表明，Cf-9、Cf-12積累活性氧和HR壞死斑點數(shù)稍高于Cf-5說明Cf-9、Cf-12發(fā)生早期防御信號較Cf-5強；細胞保護酶類測定結果表明，含Cf-5、Cf-9、Cf-12基因抗性材料各保護酶變化趨勢大致相同，但部分指標間存在顯著差異，均與對照（Cf-0）各指標在變化趨勢及變化量上差異顯著；水楊酸測定結果證實其對產(chǎn)物結構相似Cf基因介導的過敏性壞死反應作用存在差異。綜合各抗性材料、抗性生理指標與抗病性鑒定結果,表明含Cf-9基因材料對葉霉菌抗性較Cf-5、Cf-12基因材料強，抗性基因?qū)θ~霉病抗性主要通過調(diào)控體內(nèi)細胞保護酶類活性及水楊酸含量提高葉霉菌抗性。

葉霉病抗性基因；過敏反應；活性氧暴發(fā)；抗性生理指標；細胞保護酶類

網(wǎng)絡出版時間2016-8-24 15:03:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160824.1503.002.html

薛東齊,許向陽,姜景彬,等.番茄葉霉病抗性基因Cf-5、Cf-9和Cf-12介導的抗性生理研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2016,47(8):1-8.

Xue Dongqi,Xu Xiangyang,Jiang Jingbin,et al.Study on tomatoCf-5,Cf-9 andCf-12 gene mediated resitance physiological mechanism toCladosporium fulvum(syn.Passalora fulva)[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(8):1-8.(in Chinese with English abstract)

番茄（Solanum lycopersicum）受較多病原物侵擾，如番茄黃化曲葉病[1]、番茄黃萎病[2]、番茄枯萎病[3]、番茄灰霉病[4]等，這些病原物暴發(fā)均可造成番茄大面積減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)。在我國中部和北方保護地番茄栽培中，番茄葉霉菌（Cladosporium fulvum）引起的葉霉病成為威脅番茄生產(chǎn)主要真菌性病害，給番茄生產(chǎn)帶來影響[5]。目前，隨生產(chǎn)中不同番茄葉霉病抗病品種推廣，以抗病基因Cf-2、Cf-4為主的材料已被葉霉菌生理小種1.2.3.4克服，含抗病基因Cf-5、Cf-9材料也在部分地區(qū)被葉霉菌生理小種2.5、2.4.9克服[6-7]。可以看出，抗葉霉病番茄品種推廣在加劇葉霉菌生理小種分化同時，也使其流行趨勢多態(tài)化[8]。因此，挖掘新的葉霉病抗性基因，明確其抗性機理間異同成為現(xiàn)階段研究重點。

番茄抗葉霉病品種與葉霉菌發(fā)生非親和互作時，在侵染區(qū)域發(fā)生過敏性壞死反應[9]（Hypersensi?tive response，HR），主要表現(xiàn)為活性氧（Reactive ox?ygen species，ROS）分子暴發(fā)[10]，O2-、H2O2及·OH大量積累，致使體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除機制間動態(tài)平衡被打破[11]，引起細胞膜質(zhì)過氧化[12]，及細胞內(nèi)相關保護酶類變化，啟動植物抗病防衛(wèi)反應[13]。植物體內(nèi)相關保護酶類主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多分氧化酶（PPO）等，維持植物細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性。除保護酶外，植物體內(nèi)SA等也是植物抗病信號轉(zhuǎn)導途徑中重要正向調(diào)控因子[14]，這些保護酶及激素變化與植物抗病性密切相關[15]。然而，研究表明，Avr4/Cf-4介導的HR 與Avr9/Cf-9介導的HR在產(chǎn)生速度、強度和組織特異性等方面存在顯著差異[16]。為明確不同葉霉病抗性基因材料間介導的HR是否存在差異，本試驗利用含有不同葉霉病抗性基因番茄材料，研究在HR反應過程中植物體內(nèi)活性氧、細胞保護酶，及激素變化情況，以期明確葉霉病抗性基因Cf-5、Cf-9、Cf-12抗性生理異同，為進一步研究番茄與葉霉菌之間抗病機制奠定理論基礎和科學依據(jù)。

1.1材料

試驗于2015年在東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院FYSHY-7型人工氣候室和實驗室完成。供試番茄品種如表1所示，供試葉霉菌生理小種為1.2.3，均由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院番茄課題組提供。

1.2方法

1.2.1供試番茄材料與處理

將葉霉菌抗性材料Cf-5、Cf-9、Cf-12及對照Cf-0種子經(jīng)15%NaClO溶液消毒10 min，無菌水沖洗3遍，于28℃恒溫箱催芽2 d，播種于5 cm×5 cm營養(yǎng)缽中，并置于FYS-HY-7型人工氣候室，晝/夜溫度28℃/18℃，空氣濕度80%，每天光照時間16 h，80%光照強度，常規(guī)苗期管理。供試材料設3次重復，每重復10株，待番茄幼苗長至4～5片真葉時，采用噴霧法于葉背面接種葉霉菌生理小種1.2.3，接種前保持99%濕度24 h，接種后保持95%濕度，晝/夜溫度25℃/22℃，每天光照時間14 h，60%光照強度。于接種前（0 d）和接種后第1、3、5、8、12、15天分別取每株1～2片小葉，無菌水沖洗干凈，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。

1.2.2番茄葉片臺盼藍及DAB染色

為從形態(tài)學角度明確葉霉菌生理小種1.2.3與分別含Cf-5、Cf-9、Cf-12基因抗病番茄材料間非親和互作過程，以Cf-0為對照，分別取接種后第3、8、15天3個采樣時間點對接種葉片作臺盼藍染色，并取接種后第1、2、3、4天接種葉片作DAB染色。臺盼藍染色參照Faoro等方法[17]，DAB染色參照Watanabe等方法[18]，采用美國AMG EVOS倒置顯微鏡以及OLYMPUS SZX10體式顯微鏡觀察拍照。

1.2.3活性氧、細胞保護酶和激素含量測定

植物體內(nèi)活性氧H2O2含量測定采用文獻[19]等方法；細胞保護酶類SOD、POD、CAT活性測定參照趙世杰等方法[20]，PPO、PAL活性測定參照高俊鳳方法[21]；激素SA采用張玉瓊等HPLC方法測定[22]。

1.3番茄葉霉病鑒定分級

對抗性材料Cf-5、Cf-9、Cf-12及對照Cf-0接種葉霉菌生理小種1.2.3后15 d作鑒定分級，番茄葉霉病鑒定分級標準參照孟凡娟等方法[23]。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0的Duncan（D）法進行差異顯著性檢驗（P<0.05），利用Excel 2007作數(shù)據(jù)計算和圖形繪制。

2　結果與分析

2.1臺盼藍染色和抗病性鑒定

由于含Cf-5、Cf-9、Cf-12基因的抗病番茄材料與葉霉菌生理小種1.2.3發(fā)生非親和互作，產(chǎn)生HR，通過各抗性材料作葉霉病鑒定分級，結果如表2所示，Cf-9材料對葉霉菌生理小種1.2.3表現(xiàn)為免疫，而Cf-5和Cf-12表現(xiàn)為高抗。臺盼藍染色結果如圖1所示。

表2　供試番茄材料抗病性鑒定Table 2　Resistance reaction of tomato materials used for this study

圖1　葉霉菌侵染后葉片壞死情況觀察Fig.1　Necrosis symptom of leaves after infecting C.fulvum

在接種后第3、8天，對照Cf-0（CK）葉片上觀察發(fā)現(xiàn)壞死斑區(qū)域均較抗病材料葉片少，說明葉霉菌在Cf-0材料上形成較好初侵染，而在抗病材料上初侵染受阻；第15天時，對照CK產(chǎn)生大量菌絲被染色，而抗病材料未見明顯菌絲著生，但葉片壞死斑點個數(shù)和面積均較之前有明顯增多和擴大，且壞死斑點在葉片遠軸端分布較多。結合抗病性鑒定及臺盼藍染色結果可知，Cf-9介導的HR強度較Cf-5、Cf-12強，而Cf-5、Cf-12介導的HR強度相當。

2.2DAB染色觀察和H2O2測定

當抗性材料接種葉霉菌后，葉霉菌分泌效應因子Avr蛋白和Ecp蛋白激活植物早期抗病防御反應，主要表現(xiàn)為H2O2等相關活性氧大量積累。采用Patterson法和DAB染色法實時監(jiān)測H2O2暴發(fā)情況，結果如圖2所示。

隨接種后時間延長，H2O2在各抗性材料上信號強度均不斷增強，并在第2天達到高峰，其中Cf-9、Cf-12峰值稍高于Cf-5，說明Cf-9、Cf-12發(fā)生的早期防御信號較強，而第3天三抗性材料信號明顯減弱；對于感病材料Cf-0而言，H2O2信號強度在第3天達到高峰，且強度均低于抗病材料，與劉慧芹等結論一致[24]。通過結合DAB染色葉片上H2O2信號彌散程度（見圖2），證實Cf-5、Cf-9、Cf-12在早期H2O2抗病信號積累上存在差異。

圖2　葉霉菌侵染后不同抗性材料葉片H2O2積累情況Fig.2　H2O2accumulation of different resistance material after infecting C.fulvum

2.3細胞保護酶SOD活性變化

SOD作為植物細胞內(nèi)清除活性氧自由基關鍵酶，在維持細胞活性氧代謝平衡系統(tǒng)，阻止膜脂過氧化過程中發(fā)揮重要作用[12-13]。

由圖3可知，在對Cf-5、Cf-9、Cf-12及Cf-0接種葉霉菌后，抗性材料SOD活性先急劇增加，在第1天后快速下降，3 d后又快速上升，第5天后呈現(xiàn)出相對一致的緩慢增加變化趨勢；而感病材料Cf-0的SOD活性先緩慢上升，在第3天時達到高峰，后又下降，并基本維持在360 U·g-1FW水平。

總體來看，抗性材料SOD活性初始值及接種后，SOD上升幅度均遠大于感病材料，且Cf-9的SOD水平稍大于Cf-12、Cf-5，說明Cf-9抗性材料對葉霉菌的前期防衛(wèi)反應較Cf-12、Cf-5激烈。

圖3　接種葉霉菌后番茄葉片SOD活性變化Fig.3　SOD activity of tomato leaves after infecting C.fulvum

2.4細胞保護酶POD和CAT活性變化

對不同處理材料接種葉霉菌后，POD和CAT活性變化如圖4所示。

接種前，Cf-9材料POD活性稍大于Cf-0、Cf-5、Cf-12，保持在15 U·min-1·g-1FW左右；對抗性材料而言，接種后POD活性快速上升，在第3～8天時達到平臺期，之后快速上升，整個變化過程中，Cf-5、Cf-9、Cf-12材料POD活性接近，且均顯著大于Cf-0材料，說明POD在番茄對葉霉菌侵染后發(fā)生的應激反應中發(fā)揮積極作用；然而CAT活性則呈現(xiàn)為第1天有所下降，后快速上升，并在第8天達到最大峰值后又緩慢下降變化趨勢，這可能是POD與CAT相互協(xié)同作用結果。然而，對于感病材料Cf-0而言，接種后POD活性緩慢上升，并在第5～8天時達到平臺期，之后又緩慢上升，但上升幅度相對較??；而CAT活性則在第3天時達到最大值后緩慢下降，并在第15天時又上升到接近第3天時水平。

圖4　 接種葉霉菌后番茄葉片POD和CAT活性變化Fig.4　POD and CAT activities of tomato leaves after infecting C.fulvum

2.5細胞保護酶PPO和PAL活性變化

對抗病以及感病材料接種葉霉菌后，PPO以及PAL活性變化如圖5所示。

接種前，4份材料間PPO和PAL活性差異小，PPO活性含量維持在240 U·min-1·g-1FW左右；接種后，抗性材料Cf-5、Cf-9、Cf-12的PPO活性均快速增加，并在第3天出現(xiàn)一個折點，之后又快速增加，在第15天時PPO活性達到最大，差異顯著性分析可知PPO活性高低表現(xiàn)為Cf-9>Cf-12>Cf-5，且在接種后1～15 d，抗性材料PPO活性均顯著高于感病材料，原因可能是抗性材料在受到葉霉菌侵染后催化更多的酚類化合物；接種后對抗性材料PAL測定表明，其變化趨勢基本相似，主要表現(xiàn)為PAL活性在接種后迅速升高，并于第1天達到各自第一個峰值，之后PAL活性快速下降，并于第5天后PAL活性才再次上升，第15天時各材料PAL活性高于第1天時PAL峰值。而對于感病材料Cf-0而言，其PPO和PAL活性在各測定時間點均較抗性材料差異顯著。

圖5　 接種葉霉菌后番茄葉片PPO和PAL活性變化Fig.5　PPO and PAL activities of tomato leaves after infecting C.fulvum

2.6番茄植株SA含量積累動態(tài)

為明確SA在番茄對葉霉菌抗性過程中變化趨勢，測定各材料接種后葉片SA含量，結果如圖6所示。各抗性材料在接種后SA含量均快速升高，并于第3天達到最大值，但Cf-9、Cf-12材料SA積累量高于Cf-5，且接種后5 d內(nèi)保持較高水平，之后逐漸下降，第12天時Cf-9、Cf-12材料SA稍有增加，并維持在2.93 mg·g-1左右，Cf-5材料SA則維持在1.64 mg·g-1左右；感病材料Cf-0葉片內(nèi)SA水平變化趨勢相對穩(wěn)定，差異顯著性分析可知，抗性材料葉片內(nèi)SA含量在接種后始終顯著高于感病材料Cf-0。

圖6　接種葉霉菌后番茄葉片SA含量變化Fig.6　SA content of tomato leaves after infecting C.fulvum

番茄抗葉霉病基因與葉霉菌發(fā)生的非親和互作符合基因?qū)蚣僬f[25]，隨不同葉霉病抗性基因在生產(chǎn)上的推廣，以抗病基因Cf-4、Cf-5為主的材料已分別被葉霉菌生理小種1.2.3.4和2.5克服[6]，含Cf-9基因抗性番茄材料雖已應用于生產(chǎn)，但由于葉霉菌生理小種不斷分化，易出現(xiàn)廣譜或復合毒性小種，使含Cf-9基因的抗性材料失去抗病性。本研究明確番茄葉霉病抗性基因Cf-5、Cf-9、Cf-12在葉霉菌抗病性表現(xiàn)及抗性生理間差異。

研究表明植物對病原菌抗性依賴于對病原菌早期識別，從而激發(fā)ROS和啟動防衛(wèi)反應，由DAB染色可知，葉霉菌生理小種1.2.3在Cf-5、Cf-9、Cf-12抗性材料上初侵染受阻，接種后葉片內(nèi)H2O2快速、大量積累也證實這一結果，其中Cf-9、Cf-12積累的活性氧稍高于Cf-5，說明Cf-9、Cf-12發(fā)生早期防御信號較強，各材料抗病性鑒定結果與Lamb等研究結果一致[26]；侵染后期，抗性材料積累大量活性氧信號分子啟動植物防衛(wèi)反應，引起HR，表現(xiàn)為葉片上出現(xiàn)壞死斑，與小麥銹病HR表現(xiàn)一致[27]，說明不同Cf基因?qū)θ~霉菌介導的HR存在差異。

通過進一步測定細胞保護酶類SOD、POD、CAT、PAL、PPO，結果表明含Cf-5、Cf-9、Cf-12基因抗性材料各保護酶化趨勢大致相同，但部分指標間存在顯著差異，且均與對照（Cf-0）各指標在變化趨勢及變化量上差異顯著。SOD、POD、CAT作為植物細胞內(nèi)清除活性氧自由基的重要酶，其活性高低直接反映植物對體內(nèi)活性氧自由基清除能力強弱[28-29]。Cf-9材料SOD活性稍高于Cf-12、Cf-5，這可能因抗性材料在O2-清除能力及抵御脂膜過氧化能力方面具有差異；活性氧分子經(jīng)SOD歧化為H2O2，POD和CAT催化H2O2分解為H2O，與此同時POD還可催化脂肪酸、芳香胺及酚類物質(zhì)的氧，有研究表明POD可促進植保素及木質(zhì)素生成[28]，抑制病菌擴展；而CAT則主要在過氧化物酶體及乙醛酸循環(huán)中發(fā)揮作用；對POD和CAT測定結果表明，Cf-9材料在多個測定時間點與Cf-12、Cf-5材料間具有顯著差異，這可能與抗病基因在接種后被誘導表達量有關；病原菌侵染后，植物體內(nèi)會積累大量酚類及類黃酮類化合物，PPO和 PAL通過將這些物質(zhì)催化為醌、黃酮和木質(zhì)素等次生代謝物質(zhì)抵御病原菌侵染[27，30]，測定結果表明抗性品種PPO和PAL活性間大多數(shù)測定點差異不顯著，但均顯著高于感病品種，說明PPO和PAL活性升高與植物抗病性密切相關，與崔延玲[31]和齊紹武等[32]對番茄葉霉病和油菜菌核病抗性相關酶研究結果一致。通過對三抗性材料五種細胞保護酶綜合分析，結合抗病性鑒定結果，表明Cf-9材料對葉霉菌生理小種1.2.3抗性較Cf-5、Cf-12材料激烈，Cf-5與Cf-12材料抗性激烈程度相當。

Delaney和Hammond等研究SA在番茄與葉霉菌非親和互作（Cf-9/Avr9，Cf-2/Avr2）過敏壞死中的調(diào)控作用，表明SA在植物與病原物互作下游防衛(wèi)反應中起重要作用，同時也在抗性基因介導的過敏性壞死反應中發(fā)揮作用，且SA積累量受溫度、光照等多種環(huán)境因素影響[33-34]。對抗性材料SA測定發(fā)現(xiàn)Cf-9、Cf-12材料SA積累量高于Cf-5，差異顯著，說明SA對產(chǎn)物結構相同的Cf基因介導過敏性壞死反應作用存在差異，這與蔡新忠等對依賴番茄Cf-4和Cf-9基因的過敏壞死中的調(diào)控作用研究結果一致[35]。綜上所述，各抗性材料在葉霉菌抗病性表現(xiàn)以及抗性生理間差異，含Cf-9基因材料對葉霉菌抗性較Cf-5、Cf-12基因材料強，各抗性材料對葉霉病抗性主要通過調(diào)控體內(nèi)細胞保護酶類活性及SA含量增強其對葉霉菌抗性。

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Study on tomatoCf-5,Cf-9 andCf-12 gene mediated resitance physiological mechanism toCladosporium fulvum(syn.Passalora fulva)/

XUE Dongqi1,XU Xiangyang1,JIANG Jingbin1,CHAI Xinfeng2,ZHANG Hong1,LI Jingfu1(1.Tomato Research Institute,School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to clarify tomato leaf mold resistance genesCf-5,Cf-9 andCf-12 mediated hypersensitive response resistance reaction physiological differences.The experiment inoculated tomato leaf mold physiological races 1.2.3.onCf-0(CK),Cf-5,Cf-9 andCf-12 tomato materials,and compared the resistance material physiological and biochemical parameters differences of reactive oxygen species,hydrogen peroxide accumulation,salicylic acid content,superoxide dismutase, peroxidase,catalase,phenylalanine ammonia lyase,and polyphenol oxidase activities.The resultsshowed that the reactive oxygen species accumulation and the number of HR necrotic spots ofCf-9 and Cf-12 were slightly higher thanCf-5.Therefore,early defensive signals occurrence ofCf-9,Cf-12 relatively strong thanCf-5.The cytoprotective enzymes measurement results showed that changes of the protective enzyme ofCf-5,Cf-9 andCf-12 material had approximately same trends,But there were significant differences between some indicators.Each resistant material compared with the CK had significant differences in each parameter's trends and the amount of changes.The measurement results of SA confirmed that it had a different effect on the same structural genesCf-mediated HR.In summary, we knew from the resistance physiological index and resistance identification results that containingCf-9 material's resistant to tomato leaf mold disease was relatively strong thanCf-5 andCf-12 material. Resistance gene for tomato leaf mold disease mainly through the regulation of the cytoprotective enzymes activity and the content of salicylic acid to improve its resistance to PassaloraC.fulvum.

tomato leaf mold resistance genes;hypersensitive response;reactive oxygen species; resistance physiological index;cytoprotective enzymes

S641.2

A

1005-93692016）08-0001-08

2016-04-13

“十二五”國家科技計劃項目(2012BAD02B02-7)；國家自然科學基金項目（31272171，31572137）

薛東齊（1987-），男，博士研究生，研究方向為番茄抗病遺傳育種與生物技術。E-mail:xuedongqi2009@hotmail.com

李景富，教授，博士生導師，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術。E-mail:lijf_2005@126.com