李妙齡，歐賢紅，李　濤，毛　亮，楊　艷，曾曉榮

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州 646000)

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慢性心房顫動降低 Junctophilin-2在心房中的表達(dá)研究*

李妙齡，歐賢紅，李濤，毛亮，楊艷，曾曉榮△

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州 646000)

目的明確在慢性心房顫動(AF)中Junctophilin-2(JPH2)表達(dá)變化及意義。方法從心臟外科體外循環(huán)手術(shù)中獲取21例竇性心律(SR)患者和30例慢性AF患者右心房肌組織，采用免疫組織化學(xué)方法測定心房肌組織JPH2蛋白的分布；實時熒光定量PCR法檢測心房肌JPH2 mRNA水平；Western blot測定人心房肌JPH2蛋白水平。結(jié)果免疫組織化學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)SR組與AF組心房肌組織上均存在JPH2蛋白表達(dá)，SR組著色更明顯；AF組心房肌JPH2 mRNA水平和蛋白水平均明顯低于SR組(P<0.01)。結(jié)論慢性AF患者心房肌JPH2的表達(dá)下調(diào)可能與心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂密切相關(guān)。

心房顫動；心房；鈣；Junctophilin-2

心房顫動(atrial fibrillation,AF)是臨床最為常見的持續(xù)性心律失常，有較高的發(fā)病率和致死率，臨床治療效果欠佳，藥物治療還可增加室性心律失常的發(fā)生率[1]。細(xì)胞內(nèi)鈣處理異常被認(rèn)為是心房功能紊亂的最主要原因[2]。Junctophilins(JPHs)是新近發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞膜L型鈣通道(LTCC)與肌漿網(wǎng)RyR2間的膜耦聯(lián)復(fù)合物，是可興奮細(xì)胞參與細(xì)胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3]。JPHs包括4種亞型JPH1、JPH2、JPH3和JPH4，心肌上主要表達(dá)JPH2。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟JPH2基因沉默可導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣泄漏而致心力衰竭[4]，而在AF心肌中JPH2會發(fā)生怎樣的改變，目前還不清楚。

1　資料與方法

1.1一般資料所取標(biāo)本來源于2013年3～11月本院胸心外科體外循環(huán)手術(shù)患者右心房肌組織，包括竇性心律(SR)21例和慢性AF患者30例，術(shù)前所有患者均簽署了知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)取SR組5例和AF組5例患者右心房組織用于免疫組織化學(xué)染色。標(biāo)本從術(shù)中取回后經(jīng)10%福爾馬林固定后制作蠟塊后切片，給予JPH2 一抗(Abcam公司,1∶200)孵育過夜，二抗(HRP 1∶2 000)孵育30 min。應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺顯色，并在顯微鏡下觀察，顯色后5 min，復(fù)染再脫水，用中性樹膠封片。細(xì)胞膜和胞質(zhì)呈現(xiàn)二氨基聯(lián)苯胺棕黃色著色為表達(dá)陽性。

1.2.2實時熒光定量PCR法測定人心房JPH2 mRNA表達(dá)水平JPH2：上游引物5′-CTT TGA GGT GGC AGG TGT CTA-3′,下游引物5′-ATT CCG TAG CGT CCC TTG A-3′； β-actin：上游引物5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG-3′，下游引物 5′-TGT CAC GCA CGA TTT CC-3′。Trizol法提取心房肌總RNA，采用ReverTra-Plus擴(kuò)增試劑盒從1 μg總RNA中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所得cDNA以SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO) 進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

1.2.3Western blot檢測JPH2蛋白水平將心臟手術(shù)中取回的心房肌標(biāo)本于PBS液中去除血液，剪去結(jié)締組織及脂肪組織后，放入預(yù)先標(biāo)記好的EP管中于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｊ占R標(biāo)本后(SR組16例，AF組25例)于冰上凍融并剪成小塊(1 mm ×1 mm ×1 mm),加入裂解液20 mg/100 μL間斷勻漿2 min，至無明顯顆粒后，在超聲波下處理3次，每次10 s。隨后于冰上裂解30 min，再以10 000 r/min 4 ℃條件下離心10 min取上清液。取少量上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒按使用說明測定蛋白質(zhì)濃度。以每孔25 μg蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先以80 V電容40 min，再以100 V電泳120 min，電泳完成后再轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，用JPH2一抗(Abcam 1∶500)和GAPDH一抗(1∶2 000)孵育過夜，隔日用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)孵育，采用化學(xué)熒光(羅氏)顯影。

2　結(jié)　　果

2.1臨床資料特征持續(xù)性AF患者持續(xù)時間均大于6個月。AF組左房直徑明顯大于SR組，心功能Ⅳ級患者多于SR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2免疫組織化學(xué)法測定JPH2在人心房中的分布SR組心肌排列明顯比AF組有規(guī)律，呈條索狀排列；從組織著色可以看出SR組和AF組心房肌上均存在JPH2的表達(dá)，且SR組患者的棕黃色顆粒明顯多于AF組。見圖1。

2.3兩組心房肌JPH2 mRNA水平根據(jù)圖像成像掃描，在196 bp和142 bp處分別觀察到JPH2和β-actin擴(kuò)增引物，以SR組與AF組心房肌JPH2/β-actin的比值為1.00±0.21 vs.0.38±0.04(P<0.01)，經(jīng)統(tǒng)計分析表明AF組心房肌JPH2 mRNA表達(dá)水平比SR組明顯降低了(61.9±3.6)%。

2.4兩組心房肌JPH2蛋白水平根據(jù)顯影灰度值定量分析JPH2與GAPDH比值，經(jīng)統(tǒng)計SR組與AF組的比值為1.35±0.38 vs.0.62±0.21(P<0.01)。結(jié)果顯示與SR組相比，AF組JPH2降低了(54.2±4.61)%。見圖2。

表1　患者資料

*：P<0.05,△：P<0.01，與SR組比較。

A:SR組(×200);B:AF組(×200);C:SR組(×400);D:AF組(×400)。

圖1人心房肌JPH2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

A:JPH2蛋白印跡原始圖;B:標(biāo)準(zhǔn)化的JPH2蛋白的表達(dá)水平。

圖2兩組心房肌JPH2蛋白水平

3　討　　論

本實驗結(jié)果表明，JPH2均廣泛分布于SR和慢性AF患者心房肌組織中。與SR患者相比，從組織水平、基因和蛋白水平均證明了慢性AF患者心房肌JPH2表達(dá)明顯下調(diào)，表明AF改變了JPH2的正常功能，可能參與了AF的發(fā)生和維持。

JPHs是新近發(fā)現(xiàn)存在于可興奮細(xì)胞膜與肌漿網(wǎng)之間的膜耦聯(lián)蛋白，使二者保持在一個較近的距離[4]，有利于細(xì)胞膜與肌質(zhì)膜之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在興奮-收縮耦聯(lián)過程中發(fā)揮重要作用。JPHs在哺乳動物中有多種亞型分布，JPH2主要分布在心肌上，JPH2位于細(xì)胞膜L型鈣通道與肌漿網(wǎng)RyR間的連接蛋白，對細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5-6]。在生理狀態(tài)下，JPH2在心肌超微結(jié)構(gòu)形成和對心臟負(fù)荷的反應(yīng)中起到重要保障作用。JPH2功能調(diào)節(jié)異常與多種心血管疾病相關(guān)，目前對于JPH2功能異常對心臟的損害主要集中在心肌肥大及與心力衰竭的相關(guān)性研究。研究發(fā)現(xiàn)心肌肥大可引起JPH2表達(dá)下調(diào)，同樣心肌JPH2基因沉默可降低心肌興奮-收縮耦聯(lián)和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[7]。JPH2過表達(dá)不能增強(qiáng)其基本功能，但能緩解向心力衰竭的發(fā)展[8]。在心力衰竭心肌細(xì)胞上[9]，心臟負(fù)荷可導(dǎo)致JPH2的轉(zhuǎn)運(yùn)異常，JPH2失去在T管/Z線區(qū)域的正常定位，導(dǎo)致其在細(xì)胞膜上的重新分布。

不正常的細(xì)胞內(nèi)鈣處理在心房顫動的發(fā)生與維持中發(fā)揮重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)JPH2在AF時明顯下調(diào)，這表明AF使JPH2 功能下調(diào)，心房肌興奮-收縮脫耦聯(lián)，興奮收縮偶聯(lián)效率降低，細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而影響心房肌的收縮功能。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，JPH2突變E169K可導(dǎo)致陣發(fā)性AF或室上性心動過速的發(fā)生，可能與其損害細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在HL-1細(xì)胞上[11]，JPH2突變S101R,Y141H或S165F使細(xì)胞自發(fā)性鈣釋放的幅度和頻率均明顯降低。舒張期肌漿網(wǎng)鈣泄漏是AF的重要病理機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)[10]，降低JPH2表達(dá)可通過直接增加RyR2開放概率和間接降低鈉鈣交換體活性，進(jìn)而增加肌漿網(wǎng)鈣泄漏，促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展。這也間接表明AF時JPH2表達(dá)下調(diào)可能通過增加鈣泄漏而促進(jìn)AF的發(fā)展。

最新研究發(fā)現(xiàn)[10]，JPH2錯義突變降低了JPH2與RyR2間的結(jié)合比率，使RyR2功能受損導(dǎo)致舒張期肌漿網(wǎng)鈣泄漏和房性心律失常，這表明了JPH2可能是治療AF的潛在靶點。與此同時在同一期雜志上另有課題組也證明JPH2在穩(wěn)定RyR2功能中發(fā)揮重大作用，也同時證明了JPH2功能異常參與了AF鈣泄漏過程。本結(jié)果也支持了JPH2表達(dá)下調(diào)參與了AF病理生理機(jī)制的調(diào)節(jié)，為探索AF的潛在治療靶點提供理論依據(jù)。

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Down-regulation of Junctophilin-2 in human atrial from patients with chronic atrial fibrillation*

Li Miaoling,Ou Xianhong,Li Tao,Mao Liang,Yang Yan,Zeng Xiaorong△

(Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo cxplore the change and significance of Junctophilin-2(JPH2) expression in chronic atrial fibrillation(CAF).MethodsRight atrial muscle tissue of 21 patients with sinus rhythm (SR) and 30 patients with chronic atrial fibrillation (AF) were obtained from cardiopulmonary bypass surgery.The distribution of JPH2 in human atrial was assayed by immunohistochemistry technique;mRNA expression level was measured by the qRT-PCR,and the protein expression level of JPH2 was determined using Western blot analysis.ResultsImmunohistochemistry experiments found that the expression of JPH2 protein was found in right atrial muscle tissue of SR group and AF group,SR group staining was more obvious;JPH2 mRNA levels and protein levels were significantly lower in group AF than in SR group(P<0.01).ConclusionJPH2 is widely distributed in atrial muscle cells of SR group and AF group,the expression of JPH2 in patients with CAF may be closely related to the atrial myocytes calcium disorder.

atrial fibrillation;heart atria;calcium;Junctophilin-2

國家自然科學(xué)基金資助項目(81470022)；瀘州市-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合項目(2013LZLY-J23)。作者簡介：李妙齡(1972-)，副研究員，碩士，主要從事心律失常發(fā)病機(jī)制研究?！?/p>

，E-mail:lyxjd7151@163.com。

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.008

R541.7

A

1671-8348(2016)22-3046-03

2016-03-15

2016-04-18)