蔣欽 向波 于濤 黃克力

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重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對(duì)急性缺血心肌中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的影響

蔣欽 向波 于濤 黃克力

目的 探討在大鼠急性心肌缺血模型中重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）經(jīng)心肌注射移植存留率的影響。方法 結(jié)扎成年雌性SD大鼠的左前降支誘導(dǎo)心肌缺血。雄性SD大鼠來(lái)源的骨髓MSC培養(yǎng)至第三代。大鼠缺血30 min后開(kāi)放結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈，并經(jīng)缺血心肌邊緣注射4×106個(gè)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞。60只心肌缺血大鼠隨機(jī)平均分為再灌注對(duì)照（IR）組、遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)（RIPoC）組、重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)（rRIPoC）組和CXCR4抗體拮抗（CXCR4-Ab）組。遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)在后肢上實(shí)行4個(gè)周期5min缺血和再灌注。重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)在后肢上每3d實(shí)行4個(gè)周期5 min缺血和再灌注。CXCR4抗體拮抗（CXCR4-Ab）組在行rRIPoC前經(jīng)腹腔注射CXCR4特異的抗體。1個(gè)月以后，進(jìn)行心功能評(píng)價(jià)、免疫組化尋找標(biāo)記的細(xì)胞、聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)Y染色體拷貝數(shù)計(jì)算心肌中細(xì)胞存留率，采用方差分析和獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的細(xì)胞移植組顯著改善缺血心臟的左室短軸縮短分?jǐn)?shù)［rRIPoC（25.90±4.33）%，RIPoC（20.60±3.50）%，IR（16.60±3.20）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，F(xiàn)=11.422，P=0.000］和左室收縮末期內(nèi)徑［rRIPoC（5.24±0.51）mm，RIPoC（5.77±0.44）mm，IR（6.15±0.33）mm，CXCR4-Ab（5.78±0.33）mm，F(xiàn)=8.159，P=0.000］。免疫組化發(fā)現(xiàn)重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)組的心臟內(nèi)細(xì)胞滯留率更高，PCR檢測(cè)MSC滯留比例［rRIPoC（2.33±0.46）%，RIPoC（1.85±0.50）%，IR（1.42±0.27）%，F(xiàn)=8.189，P=0.000］；特異CXCR4抗體阻斷降低重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)誘導(dǎo)的心臟內(nèi)高細(xì)胞滯留率［rRIPoC（2.33±0.46）%，CXCR4-Ab（1.82±0.36）%，n=10，P=0.014］和心臟收縮功能改善［rRIPoC（25.90±4.33）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，P=0.003］。結(jié)論 重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)較單次遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)提高經(jīng)心肌注射移植的骨髓MSC在心臟中的移植存留率。CXCR4受體在重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)后期誘導(dǎo)的心肌高移植存留率中發(fā)揮重要作用。

骨髓； 間質(zhì)干細(xì)胞移植； 心肌梗死； 心肌缺血

經(jīng)心肌注射途徑移植細(xì)胞是臨床上最直接有效的移植方法。但細(xì)胞注射到心肌后細(xì)胞可能進(jìn)入血液循環(huán)再分布，滯留在心肌的比例大大降低［1］。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植（cell transplantation，CTx）的數(shù)量多少明顯影響其療效［2］。如何提高細(xì)胞在缺血心肌區(qū)域的數(shù)量和存活比例一直是CTx實(shí)驗(yàn)的研究熱點(diǎn)。有研究顯示缺血后適應(yīng)可以通過(guò)旁分泌作用改善缺血組織的微環(huán)境提高經(jīng)心肌注射的移植效率［3］。筆者之前的研究顯示在心梗模型中缺血后適應(yīng)可以提高經(jīng)靜脈路徑注射的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞募集到缺血心?。?］。本研究探討重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)是否可以在急性心肌缺血大鼠模型中較單次缺血后適應(yīng)提高經(jīng)心肌途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）的移植效率及治療作用。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本實(shí)驗(yàn)所使用的動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，雄性體重約為60g（約為3周齡），用于分離培養(yǎng)骨髓MSC；雌性體重為250～300g（約為8周齡），用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。所有操作均按照英國(guó)動(dòng)物1986條例和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生局出版的指南相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

2.主要試劑及器材:低糖DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清和磷酸鹽緩沖液由美國(guó)GIBCO公司提供；5-溴脫氧尿嘧啶核苷和小鼠來(lái)源單克隆抗Brdu抗體由美國(guó)Sigma-Aldrich公司提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀由美國(guó)invitrogen公司提供，小動(dòng)物呼吸機(jī)由哈佛生物科技公司提供，倒置熒光顯微鏡由日本Nikon公司提供，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由美國(guó)ABI公司提供。

二、方法

（一）MSC的分離

外科手術(shù)分離雙側(cè)脛股骨沖洗骨髓腔貼壁培養(yǎng)法。通過(guò)頸椎脫臼法處死大鼠后，置入盛有75%酒精容器中消毒3～5min，剪開(kāi)整個(gè)后肢皮膚，剝下全層皮膚。使用眼科剪將股骨周圍肌肉盡量剔除并修剪關(guān)節(jié)囊。游離完畢的脛骨和股骨放入盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。使用5ml注射器抽吸培養(yǎng)基，從關(guān)節(jié)頭端刺入，將關(guān)節(jié)腔內(nèi)的骨髓反復(fù)多次沖洗至培養(yǎng)皿中，直至關(guān)節(jié)腔顏色變白，使用電動(dòng)吸引器連接10ml的吸管將含骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)基均勻轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。

（二）動(dòng)物模型

1.實(shí)驗(yàn)心肌缺血模型制作［2］:所有實(shí)驗(yàn)均采用10%水合氯醛（3.0～3.5ml/kg體重）腹腔注射麻醉大鼠，行氣管插管。調(diào)節(jié)好小動(dòng)物呼吸機(jī)的參數(shù)（60次/min，吸氣/呼氣=1∶1～1.5，潮氣量=10ml/kg）。連接呼吸機(jī)，觀察胸廓起伏情況；左胸第四肋間區(qū)域（乳頭下方）橫切口，長(zhǎng)1cm，鈍性分離肋骨外肌肉層；貼第四肋骨上緣（第四肋間隙）前外側(cè)開(kāi)胸，胸骨撐開(kāi)器分開(kāi)上下肋間隙；使用顯微鑷撕開(kāi)心包膜，并分向兩側(cè)；以6-0prolene線于左心耳與肺動(dòng)脈流出道交匯處以遠(yuǎn)2mm處作橫向縫扎；縫扎的中點(diǎn)位于左心耳與肺動(dòng)脈流出道交匯處與心尖連線，進(jìn)針?lè)较蚺c連線垂直，進(jìn)針深度為1.5mm。如心臟跳動(dòng)減弱或心尖區(qū)域顏色變白可大致證實(shí)心肌缺血模型制作成功，不明顯者再次縫扎。如有心律失常發(fā)生，給予低濃度利多卡因紗布敷蓋左室或心臟按摩。若缺血30min后無(wú)左心擴(kuò)大變白或運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，則認(rèn)為心肌缺血模型制作不合格。

2.遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)模型制作:所有心肌缺血大鼠隨機(jī)分為四組。遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)組（remote ischemic postconditioning，RIPoC）即在大鼠左下肢根部使用血管加壓帶，加壓阻斷股動(dòng)脈血流。阻斷5min后釋放加壓帶5min；交替進(jìn)行4個(gè)周期。重復(fù)遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)組（repeated RIPoC，rRIPoC）即每3d重復(fù)施行一次RIPoC。對(duì)照組（ischemia reperfusion，IR）直接進(jìn)行細(xì)胞移植。為了驗(yàn)證SDF-1α/CXCR4軸在rRIPoC參與經(jīng)心肌途徑移植細(xì)胞中的作用，兔抗大鼠CXCR4多抗（10μg/kg，英國(guó)Abcam公司）在首次RIPoC結(jié)束后注射至大鼠腹腔內(nèi)，列為CXCR4-Ab組。

（三）細(xì)胞標(biāo)記與細(xì)胞移植

細(xì)胞標(biāo)記使用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。培養(yǎng)的骨髓MSC在終濃度為10μmol/L的BrdU中37℃孵育1h即可以與DNA結(jié)合。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀確定注射細(xì)胞的濃度。MSC收集重懸（4×107/ml，PBS懸浮），抽吸前搖勻數(shù)次，每只注射器吸取100μl懸液。將注射器成角30度在心肌梗死邊緣三點(diǎn)均勻緩慢注射。

（四）細(xì)胞移植定性計(jì)數(shù)

小鼠來(lái)源單克隆抗Brdu抗體（B531，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。利用抗Brdu單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，定性半定量評(píng)價(jià)移植細(xì)胞數(shù)量。

（五）細(xì)胞移植定量計(jì)數(shù)

心功能測(cè)定后，靜脈注射氯化鉀，處死大鼠取出心臟。組織勻漿后提取DNA，PCR計(jì)數(shù)SRY基因拷貝數(shù)。SRY引物序列為F:CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA；R:ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC；一定量的DNA進(jìn)行10倍梯度的稀釋，行PCR實(shí)驗(yàn)完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。首先根據(jù)梯度細(xì)胞計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再以標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式，算出各樣本中Ct值對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)，結(jié)合DNA使用量、組織勻漿體積、組織重量計(jì)算各樣本心臟總的存留數(shù)量。

（六）左心功能檢測(cè)

經(jīng)胸ECG檢測(cè)左室心功能細(xì)胞移植后1個(gè)月進(jìn)行（n=10）。影像通過(guò)12MHz頻率測(cè)量轉(zhuǎn)換器（飛利浦SONOS5500，北京飛利浦公司）獲取。通過(guò)二維超聲獲取胸骨旁長(zhǎng)軸和短軸面乳頭肌水平影像。測(cè)量結(jié)果為3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。其中左室收縮末期直徑（LVESD）和左室舒張末期直徑（LVEDD）直接測(cè)出。左室短軸縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，細(xì)胞存留比例和心功能參數(shù)多組比較采用單因素方差分析，組間差異采用兩樣本t檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

在模型制作方面術(shù)者已有前期工作基礎(chǔ)［2］，手術(shù)方式較固定，大鼠心肌缺血模型的制作成功率約在80%，主要的死亡原因是由于解剖變異因素結(jié)扎冠脈分支過(guò)多或者主干較近導(dǎo)致心梗面積太大，呼吸系統(tǒng)包括氣道因素，術(shù)后氣胸形成等原因。共計(jì)60只心肌缺血制作合格的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表劃分為4組，因測(cè)定Y染色體拷貝數(shù)計(jì)數(shù)細(xì)胞存留率，故采取雄性大鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到雌性大鼠的異性移植模型。遠(yuǎn)程缺血后處理的制作無(wú)肢體缺血壞死或死亡發(fā)生。

二、MSC染色后計(jì)數(shù)結(jié)果

如圖1所示，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果，圖示染成藍(lán)色細(xì)胞代表死細(xì)胞或細(xì)胞碎片，平均尺寸為10μm，無(wú)染色的細(xì)胞代表存活細(xì)胞，平均直徑為17.2μm，存活比例96%以上。

圖1 移植前已染色的MSC存活情況（臺(tái)盼藍(lán)染色×100）

三、免疫組化檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞移植各組均能檢測(cè)到抗BrdU陽(yáng)性染為棕黑色的細(xì)胞核，而心肌細(xì)胞核染為藍(lán)色；幾乎所有的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞（對(duì)應(yīng)為移植細(xì)胞）均分布在梗死心肌邊緣區(qū)（n=5）。從四組心臟組織免疫組化染色結(jié)果可以看出rRIPoC誘導(dǎo)后細(xì)胞移植組陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于RIPoC治療組和IR組（圖2，棕黑色細(xì)胞代表移植細(xì)胞）。每高倍鏡視野下BrdU陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)［rRIPoC組（10.6±3.4），RIPoC組（6.6±2.4），IR組（2.6±1.1），CXCR4-Ab組（5.8±1.9），n=5，F(xiàn)=9.798，P=0.001）。

四、移植細(xì)胞各組心臟存留率

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及各組的擴(kuò)增Ct值結(jié)果，換算出各組的細(xì)胞存留比例［rRIPoC組（2.33±0.46）%，RIPoC組（1.85±0.50）%，IR組（1.42±0.27）%，CXCR4-Ab組（1.82±0.36）%，n=10，F(xiàn)=8.189，P=0.000）］。相對(duì)于IR組，RIPoC增加MSC移植后在心肌存留比例130.3%（P＜0.05）；rRIPoC增加MSC移植后在心肌存留比例164.1%（P＜0.05）。CXCR4特異的阻斷抗體降低rRIPoC的移植效率，且與RIPoC組結(jié)果類似（P＞0.05，表1）。

表1 4組大鼠術(shù)后1個(gè)月心肌組織中移植的MSC定量情況

五、細(xì)胞移植治療后的各組心功能

rRIPoC處理的細(xì)胞移植組的LVFS明顯提高［rRIPoC（25.90±4.33）%，IPoC（20.60±3.50）%，IR（16.60±3.20）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，n=10，F(xiàn)=11.422，P=0.000］，LVESD顯著性降低［rRIPoC（5.24±0.51）mm，IPoC（5.77±0.44）mm，IR（6.15±0.33）mm，n=10，F(xiàn)=8.159，P=0.000］，而LVEDD僅較IR組縮?。踨RIPoC（7.06±0.40）mm，IR（7.37±0.35）mm，P=0.046］（表2）。

表2 4組大鼠細(xì)胞移植術(shù)后1個(gè)月心功能變化（n=10，± s）

表2 4組大鼠細(xì)胞移植術(shù)后1個(gè)月心功能變化（n=10，± s）

注:與rRIPoC組比較，aP＜0.05；IR組比較，bP＜0.05

組別　LVEDD（mm）　LVESD（mm）　LVFS（%）rRIPoC 　7.07 ± 0.40　5.24 ± 0.51　25.90 ± 4.33 RIPoC　7.25 ± 0.29　5.77 ± 0.44ab　20.60 ± 3.50abIR　7.37 ± 0.35a　6.14 ± 0.33a　16.00 ± 3.20aCXCR4-Ab　7.22 ± 0.27　5.78 ± 0.33a　20.00 ± 3.23abF 值　1.457　8.159　11.422 P 值　0.243　0.000　 0.000

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察術(shù)后1個(gè)月心肌組織中移植的MSC免疫組化染色情況（×100）

討 論

本實(shí)驗(yàn)表明在大鼠急性心肌缺血模型中，rRIPoC提高經(jīng)心肌注射途徑CTx的移植效率和治療心肌缺血的療效。相對(duì)于RIPoC通過(guò)改善心肌缺血后微環(huán)境提高心內(nèi)細(xì)胞存留比例，rRIPoC后期主要作用是通過(guò)募集經(jīng)心肌注射后體內(nèi)再分布的細(xì)胞所致。

干細(xì)胞移植治療心肌梗死是一個(gè)備受關(guān)注的研究領(lǐng)域［4］。多數(shù)研究表明CTx治療心梗具有一定的療效。目前干細(xì)胞治療已進(jìn)入三期臨床實(shí)驗(yàn)，表明其逐漸演化為一種生物制劑［5］。但是一直以來(lái)都面臨心內(nèi)細(xì)胞難以駐留、存留比例極低這個(gè)共同難題［6］。盡管細(xì)胞在體內(nèi)的具體作用機(jī)制仍未明確，但是基本上不支持MSC向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，多認(rèn)為與細(xì)胞移植后在心肌產(chǎn)生分泌作用有關(guān)［7］。因此理論上更多的細(xì)胞停留在心臟可以提高治療效率。研究顯示經(jīng)心肌注射骨髓供體細(xì)胞在心臟中的比例由最初的34%～80%降低到6周時(shí)的0.3%～3.5%。早期細(xì)胞死亡及后期細(xì)胞再分布至其他臟器是心臟存留比例下降的主要原因［1］。

RIPoC可以減輕心肌缺血再灌注損傷，提供經(jīng)心肌注射移植細(xì)胞“友好的”微環(huán)境［8］。細(xì)胞移植到RIPoC作用后的心肌理論上可以增加細(xì)胞的幸存［3］。再灌注時(shí)線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開(kāi)放，及時(shí)RIPoC能夠延遲線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開(kāi)放，減輕心肌缺血再灌注損傷發(fā)生［9］。在體大鼠實(shí)驗(yàn)將首次再阻斷的時(shí)間從再灌注后10s推移到60min，缺血后適應(yīng)減少心梗面積的效應(yīng)就會(huì)丟失［10］。因此，理論上為期1個(gè)月的rRIPoC后期不能像早期產(chǎn)生突出的心臟保護(hù)作用，也就不能為移植細(xì)胞提供“友好的”微環(huán)境。

在大鼠心梗模型中研究采取了缺血期間施行缺血適應(yīng)后每3d或每天施行缺血后適應(yīng)三組對(duì)比研究心室重構(gòu)和生存率。該研究發(fā)現(xiàn)首次RIPoC后rRIPoC相比單次缺血期間適應(yīng)方案效果可以數(shù)量-效應(yīng)方式減輕心室重構(gòu)并增加生存率［11］。而且首次RIPoC后每天rRIPoC其作用效果最強(qiáng)。但綜合考慮到實(shí)驗(yàn)效應(yīng)以及簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)方案，故本研究采取每3d的rRIPoC的實(shí)驗(yàn)方案。

既往研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)后期通過(guò)募集骨髓干細(xì)胞保護(hù)缺血再灌注的損傷［12］。既往研究發(fā)現(xiàn)RIPoC這種無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單、可反復(fù)利用的心肌保護(hù)技術(shù)改善經(jīng)靜脈途徑CTx的效率［2］。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIPoC可以誘導(dǎo)亞急性梗死心肌-血液間SDF-1梯度產(chǎn)生，聯(lián)合CTx治療亞急性心梗后可以改善心功能。而通過(guò)特異性阻斷骨髓MSC上SDF-1α對(duì)應(yīng)的CXCR4抗體，降低了靜脈注射細(xì)胞在心臟中存留率。其原理是RIPoC可以通過(guò)提高心肌組織的SDF-1濃度募集經(jīng)靜脈途徑移植的帶有CXCR4骨髓MSC到缺血心肌組織。

理論上rRIPoC早期改善經(jīng)心肌注射移植的移植環(huán)境和后期募集再分布至其他器官的細(xì)胞回到心肌。rRIPoC輔助CTx有兩個(gè)不同的作用:第一，早期RIPoC可以減輕缺血心肌的再灌注損傷，為細(xì)胞移植提供更“友好的”微環(huán)境；第二，后期重復(fù)RIPoC最早在第3天，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)心肌保護(hù)的最大時(shí)間（60min）［10］，故對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開(kāi)放影響甚小。但在急性心梗期后可誘導(dǎo)心肌-血液中SDF-1的濃度梯度形成，募集早期心肌注射后再分布到其他器官或者血液循環(huán)中的移植細(xì)胞進(jìn)入心臟。

為了驗(yàn)證CXCR4受體在rRIPoC參與經(jīng)心肌途徑移植細(xì)胞中的作用，采用CXCR4特異性抗體注射至大鼠腹腔內(nèi)，通過(guò)抗體阻斷間充質(zhì)細(xì)胞表面上CXCR4受體，從而阻斷CXCR4受體在細(xì)胞募集中的作用，因而僅保有單次RIPoC改善心肌微環(huán)境的效能。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)rRIPoC提高經(jīng)心肌注射途徑CTx的心內(nèi)存留率具有明顯的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義。首先，早期RIPoC是一種內(nèi)源性心肌缺血保護(hù)策略，肢體實(shí)行RIPoC安全無(wú)創(chuàng)；本實(shí)驗(yàn)中實(shí)行RIPoC無(wú)肢體缺血壞死情況。其次，RIPoC可以廣泛反復(fù)施行且不受時(shí)間限制。臨床應(yīng)用中，通過(guò)加壓止血帶在肢體上加壓和放氣實(shí)行RIPoC。最后，后期多次重復(fù)RIPoC產(chǎn)生有利于移植細(xì)胞募集到缺血心肌的作用信號(hào)。

rRIPoC較單次RIPoC［13］能夠提高經(jīng)心肌注射途徑CTx的心內(nèi)細(xì)胞存留率，并且改善CTx治療后缺血心臟的心功能。CXCR4受體在rRIPoC后期提高M(jìn)SC經(jīng)心肌注射移植的心臟內(nèi)細(xì)胞存留率的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。相比于使用細(xì)胞預(yù)處理方式提高細(xì)胞在心肌的存活率［14］，rRIPoC是提高經(jīng)心肌注射途徑CTx治療心梗的一項(xiàng)簡(jiǎn)便、安全、有效的策略。

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（本文編輯:蔡曉珍）

Effects of repeated remote ischemic postconditioning on bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in acute ischemic myocardium

Jiang Qin， Xiang Bo， Yu Tao， Huang Keli. Department of Cardiac Surgery， Sichuan Provincial People's Hospital， Chengdu 610072，China
Corresponding author: Huang Keli， Email:kelihuang028@hotmail.com

Objective To investigate the effect of repeated remote ischemic postconditioning（rRIPoC）on the retention of mesenchymal stem cells in the acute rat myocardial ischemia model. Methods Myocardial ischemia of adult female SD rats was induced by ligation of the left anterior descending（LAD）coronary artery for 30 minutes. Male SD rat-derived mesenchymal stem cell（MSC）were harvested from bone marrow. Cells of the third passage were used. A total of 4 × 106MSC were intramyocardially infused into 60 femaleMI rats which were randomly assigned into IR， RIPoC， rRIPoC， and CXCR4-Ab groups. RIPoC group was induced with 4 cycles of 5-minute occlusion and reperfusion of the limb. rRIPoC group was induced with 4 cycles of 5-minute occlusion and reperfusion of the limb every three days. For CXCR4-Ab group， anti-CXCR4 antibody was intraperitoneally administered before rRIPoC procedure. One month later， all groups underwent left ventricular function examination. MSC engraftment in the myocardium was evaluated by immunohistochemistry （IHC）examination and quantitative polymerase chain reaction（PCR）for SRY gene in Y chromosome.Statistical analysis was conducted with two-way ANOVA and t test. Results MSC significantly ameliorated left ventricular shortening fraction ［rRIPoC （25.90±4.33）%，RIPoC（20.60±3.50）%，IR（16.60±3.20）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，F(xiàn)=11.422，P=0.000］ and left ventricular end-systolic diameter［rRIPoC（5.24±0.51）mm，RIPoC（5.77±0.44）mm，IR（6.15±0.33）mm，CXCR4-Ab（5.78±0.33）mm，F(xiàn)=8.159，P=0.000］.IHC examination for labeled infused cells and PCR analysis for Y chromosome demonstrated that rRIPoC significantly increased MSCs retention in myocardium［rRIPoC（2.33±0.46）%， RIPoC（1.85±0.50）%， IR（1.42±0.27）%， F = 8.189， P = 0.000］.Furthermore， blockade with anti-CXCR4 antibody before rRIPoC markedly decreased therapeutic efficacy［rRIPoC（2.33±0.46）%， CXCR4-Ab（1.82±0.36）%，n=10，P=0.014］and LVFS［rRIPoC（25.90±4.33）%， CXCR4-Ab（20.00±3.23）%， P = 0.003］. Conclusions rRIPoC enhanced the retention of the intramyocardially infused MSCs in the ischemic myocardium compared with RIPoC. CXCR4 receptor played a pivotal role in rRIPoC-induced MSC retention.

Bone marrow； Mesenchymal stem cell transplantation； Myocardial infarction； Myocardial ischemia

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.003

四川省人民醫(yī)院博士基金（30305030842）

610072 成都，四川省人民醫(yī)院心臟外科中心

黃克力，Email:kelihuang028@hotmail.com

2015-08-03）