曾桂芳謝長峰徐紹坤杜杰李嬋李陶左叢林劉沐蕓胡祥

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人臍帶間充質(zhì)干細胞對腫瘤細胞生長及軟瓊脂克隆形成的影響

曾桂芳1謝長峰1徐紹坤1杜杰2李嬋1李陶1左叢林2劉沐蕓1胡祥1

目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUCMSC）體外共培養(yǎng)對腫瘤細胞增殖的影響以及在軟瓊脂中形成克隆的可能性，從而評價其體外促瘤性和致瘤性，為其體內(nèi)致瘤性研究及臨床應用提供安全性數(shù)據(jù)。方法 剝?nèi)∧殠A通氏膠，剪碎，組織塊貼壁法獲得貼壁細胞，培養(yǎng)傳代，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀測定細胞表型，檢測誘導成脂肪和成骨及成軟骨分化的能力，鑒定是否為hUCMSC。然后，通過體外軟瓊脂克隆形成實驗觀察hUCMSC形成集落的能力；hUCMSC分別與人白血病細胞株K562和人結腸癌細胞株Colo-205體外共培養(yǎng)，MTT法測定細胞增殖，并以腫瘤細胞的增殖指數(shù)（PI）值來判定hUCMSC是否對腫瘤細胞體外增殖有影響 。結果 人臍帶華通氏膠分離培養(yǎng)的細胞具有成纖維細胞樣的細胞形態(tài)，具有向成脂肪和成骨及成軟骨方向分化的能力，表達間充質(zhì)干細胞指標CD73、CD90、CD105，低表達CD34、CD45、CD19，符合間充質(zhì)干細胞特點。軟瓊脂克隆形成實驗顯示hUCMSC未表現(xiàn)出在阻力介質(zhì)中的克隆生長能力。hUCMSC分別與人白血病細胞K562和人結腸癌Colo-205細胞共培養(yǎng)，PI值顯示hUCMSC對腫瘤細胞增殖沒有影響。結論 hUCMSC體外培養(yǎng)不具有致瘤性，同時對腫瘤細胞增殖無影響。

臍帶； 間質(zhì)干細胞； 細胞分化； 致瘤性

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種能夠自我更新，具有多向分化潛能的祖細胞［1］。人們已經(jīng)在人多種組織內(nèi)分離出MSC并在體內(nèi)體外分化得到多種終末分化細胞，如骨［2-4］、軟骨［5-6］、肌腱［7-9］、肌肉［10-12］、脂肪［13，4］、造血支持細胞［14］等。骨髓來源的MSC由于其免疫調(diào)節(jié)的特性，是用于治療免疫性疾病的主要候選細胞［15］。但由于骨髓源性MSC取材時對供者有侵入性損傷，給供者帶來痛苦，并且存在病毒污染的可能，所以研究者希望能找到替代骨髓MSC，彌補其缺陷的MSC來源。人們試著從其他組織中獲得MSC，比如從臍血和外周血中獲得細胞，但是具有一定難度，且在足月分娩的臍血或動員的外周血中MSC的數(shù)量尚存在爭議［16-18］。近年較多學者從娩后的廢棄組織臍帶中分離和培養(yǎng)MSC，臍帶中的華通氏膠不但含有豐富的MSC，且其來源的細胞在形態(tài)學、擴增能力、分化功能，以及表面標志物等生物學鑒定結果都符合間充質(zhì)干細胞的標準［19］，為MSC的基礎和臨床研究提供了新材料來源和基礎資料［17］。臍帶取材對供者不具有侵入性損傷和倫理道德的問題，被認為是代替骨髓來源MSC最佳材料［15］。

人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cordderived mesenchymal stem cell，hUCMSC）缺乏HLA-Ⅱ類分子和共同刺激分子的表達，具有特殊的免疫學表型，不引起同種異體淋巴細胞增殖反應［20］。由于其免疫學特性，移植入宿主體內(nèi)的MSC不引起宿主的免疫排斥反應，通過細胞間的相互作用以及旁分泌等方式抑制T細胞的增殖及其過度免疫反應，從而發(fā)揮免疫重建作用［21］。

目前hUCMSC臨床應用的最大憂慮依然是其安全性，其中致瘤性又是其安全性中的關注重點。本文旨在通過體外實驗研究hUCMSC是否具有致瘤性，為體內(nèi)致瘤性實驗及其臨床使用提供安全性數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、材料

在產(chǎn)婦及家屬知情并同意捐贈的情況下，獲取足月妊娠剖腹產(chǎn)分娩的胎兒臍帶；CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；酶標儀（MODEL 1550，日本BIO RAD公司）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；人胚肺成纖維細胞（MRC-5）、人宮頸癌細胞（Hela）、人白血病細胞株K562和人結腸癌細胞株Colo-205均購于中國醫(yī)學科學院基礎研究所細胞中心；低熔點瓊脂糖（美國Amresco公司）。

二、方法

（一）hUCMSC分離培養(yǎng)

取合適的剖腹產(chǎn)嬰兒臍帶，用手術線將準備采集的臍帶兩端結扎，剪取已經(jīng)結扎的臍帶放入無菌的臍帶采集瓶中，盡快運輸至實驗室處理。實驗室接受臍帶后，無菌操作分離培養(yǎng)Wharton'sjelly源性間充質(zhì)干細胞。先用無菌PBS洗去臍帶殘存血液及雜質(zhì)后，將臍帶剪成2～3cm的小段，用有齒鑷子輕輕撕開每小段臍帶，暴露出臍帶里面的華通氏膠以及血管。剝除臍帶里面的兩條靜脈及一條動脈后，輕輕撕下華通氏膠，羊膜廢棄。將獲得華通氏膠剪碎至1mm3大小，加入含10%FBS（Gibco）DMEM/F12（Hyclone）于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～6天后進行首次換液，以后每隔3d進行換液1次。細胞長到70%～80%融合時使用0.25%胰酶進行消化傳代。

（二）hUCMSC細胞表面抗原分析

取至少1×106個細胞樣品移入相應流式管內(nèi)，加入PBS充分混勻，離心洗滌2次；加入適量PBS混懸細胞，過濾，計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為（2.0～6.0）×106個/ml待用；每個抗原檢測需同時設1支同型對照管，并用記號筆在試管外壁上標記清楚抗體及同型對照信息，按照管上標記抗體及同型信息加入相應抗體及同型對照試劑；然后將準備好的細胞樣品混勻后，取100μl細胞懸液至已加入抗體試劑的流式管內(nèi)，將細胞懸液與抗體試劑充分混勻，孵育30min；孵育完成后每管加入PBS，充分混勻，洗滌1次，調(diào)整細胞懸液體積至200μl左右，準備上機檢測。檢測細胞的陽性抗原表達CD73、CD90、CD105不低于95%，陰性抗原表達CD14、CD19、CD34、CD45、HLADR不得過2%。

（三）hUCMSC多向誘導分化

取需要檢測分化的細胞鋪板于6孔板中，用含10%FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。待細胞生長達70%～80%融合度時，將培養(yǎng)基更換為成脂、成骨、成軟骨的定向分化誘導液進行培養(yǎng)，并定期進行換液。各組誘導分化細胞均另設含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)的細胞為對照。

1.向成脂肪細胞誘導分化:在細胞生長達70%～80%融合時加入脂肪細胞分化誘導液（GIBCO），對照為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3～4d進行換液1次。每天使用倒置顯微鏡觀察細胞生長的狀況以及形態(tài)的變化，當脂滴出現(xiàn)后（約3周后）用4%多聚甲醛固定細胞10min，PBS洗滌，1%油紅O染色15min，PBS洗滌后在光學顯微鏡下觀察脂肪滴的現(xiàn)象，并拍照。

2.向成骨細胞誘導分化:在細胞生長達70%～80%融合時加入成骨細胞分化誘導液對照為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每3～4d全量換液1次。每天使用倒置顯微鏡觀察細胞生長的狀況以及形態(tài)的變化，觀察出現(xiàn)鈣化結晶及結節(jié)后（約4周）用4%多聚甲醛固定細胞10min，PBS洗滌，用1%茜素紅染30min后光鏡下觀察有無鈣化基質(zhì)沉淀的現(xiàn)象并拍照。

3.向成軟骨細胞誘導分化:取一定細胞加入到15ml離心管中離心，加入成軟骨細胞誘導液，對照為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每3～4d全量換液1次。誘導2～3周后，進行常規(guī)石蠟包埋切片，1%阿爾新藍染色，光鏡下觀察軟骨細胞。

（四）軟瓊脂克隆實驗

在6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)無菌操作鋪備0.6%底層瓊脂，待室溫凝固后，將培養(yǎng)板置于2℃～8℃保存?zhèn)溆?。在使用前，先將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中進行復溫。收獲對數(shù)生長期的細胞制備成單細胞懸液，按不同密度配成0.35%上層瓊脂。根據(jù)文獻［22］將受試細胞hUCMSC終濃度分別設定為500、1000、2000個/孔。同時設立陽性對照孔（Hela細胞，1000個/孔）和陰性對照（MRC-5，1000個/孔）以及空白對照孔，每組設3個平行孔。待培養(yǎng)基在室溫凝固后，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21d。培養(yǎng)結束后，顯微鏡下觀察，16個以上細胞組成的細胞團計為1個集落，計算細胞集落總數(shù)。

（五）MTT法檢測hUCMSC體外對腫瘤細胞增殖的影響

采用人白血病細胞株K562和人結腸癌細胞株Colo-205，實驗設空白對照組（無細胞培養(yǎng)基組）、陽性對照組（腫瘤細胞+順鉑組）、hUCMSC對照組（單純hUCMSC組）、hUCMSC實驗組（hUCMSC+腫瘤細胞組）。K562細胞濃度分別為1.25×104，2.5×104，5.0×104個/ml；Colo-205細胞濃度分別為1.25×104，2.5×104，5.0×104，1.0×105，2.0×105個/ml，每個濃度設3個平行孔。順鉑濃度為4μg/ml，于腫瘤細胞接種1h后加入。hUCMSC細胞1.0×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，24h后經(jīng)60Co12.5Gy照射后作為共培養(yǎng)鋪層細胞，照射后4h接種腫瘤細胞，繼續(xù)培養(yǎng)72h后MTT法檢測細胞增殖情況，并計算腫瘤細胞的增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。PI=（實驗組或陽性對照組吸光度（A）值－空白對照（A）值）/（陰性對照組（A）值－空白對照（A）值）。將各組PI進行統(tǒng)計分析，比較不同濃度下的腫瘤細胞增殖情況，以PI值在（1.0±0.3）之內(nèi)為對細胞增殖無影響。

結 果

一、hUCMSC的分離、擴增及鑒定

用組織塊貼壁法分離hUCMSC，1周后于組織塊間隙已可見散在分布的長條索狀紡錘形細胞（圖1）。貼壁細胞多為長梭形或扁平形的成纖維樣細胞，折光度好，核仁明顯。

圖1 倒置顯微鏡下觀察貼壁生長的hUCMSC（×40）

二、細胞免疫表型檢測

流式細胞儀檢測表明:貼壁細胞均強表達CD73、CD90、CD105，不表達造血細胞表型CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR（圖2）。

圖2 hUCMSC細胞表面抗原分析細胞流式圖

三、體外誘導分化檢測

脂肪誘導第14天倒置顯微鏡下即可見細胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成，第21天油紅O染色呈強陽性（圖3a），未加脂肪誘導培養(yǎng)基的對照組細胞無脂滴形成，油紅O染色陰性（圖3b）。成骨誘導第28天，實驗組茜素紅染色可見細胞間紅色鈣化基質(zhì)沉積（圖3c），未加成骨誘導培養(yǎng)基的對照組細胞茜素紅染色未見紅色礦化物沉積（圖3d）成軟骨誘導第21天，實驗組阿爾新藍染色可見明顯藍色斑塊沉積（圖3e），對照組則不明顯（圖3f）。

四、軟瓊脂克隆實驗

陽性對照組1周時有110.7個集落出現(xiàn)，2周時為379.7個，3周時為501.7個（圖4）?？瞻讓φ战M、陰性對照組及供試品低、中、高劑量組在培養(yǎng)后3周內(nèi)均未見細胞集落產(chǎn)生。

五、hUCMSC體外對腫瘤細胞增殖的影響

體外細胞試驗結果表明，將1.0×105個/ml的hUCMSC與1.25×104、2.5×104、5.0×104個/ml濃度的懸浮生長人白血病細胞K562共培養(yǎng)，即其相應細胞比例為1:8、1:4、1:2時，與順鉑陽性對照組相比，對K562細胞增殖無明顯作用（表1）。1.0×105個/ml的hUCMSC與1.25×104、2.5 ×104、5.0×104個/ml、1.0×105個/ml和2.0×105個/ml濃度的貼壁生長人結腸癌細胞Colo-205共培養(yǎng)，即其相應細胞比例為1:8、1:4、1:2、1:1和2:1時，與順鉑陽性對照組相比，hUCMSC共培養(yǎng)對Colo-205細胞增殖無明顯作用（表2）。

討 論

圖3 倒置顯微鏡下觀察hUCMSC誘導分化結果

圖4 光學顯微鏡下觀察軟瓊脂克隆實驗細胞接種第3周時細胞形態(tài)（×20）

MSC來源于中胚層間充質(zhì)，主要存在于全身結締組織和器官間質(zhì)中，目前研究較多的MSC主要來源于骨髓、臍血、臍帶、外周血和脂肪組織。臍帶是胎兒分娩后廢棄組織，獲取過程對供者無不利影響，經(jīng)產(chǎn)婦自愿捐贈，不存在倫理道德風險，且所獲細胞增殖、分化能力強，適合體外大規(guī)模培養(yǎng)，產(chǎn)品化前景較強，因此臍帶MSC逐漸成為MSC移植的主要來源，也成為國內(nèi)外商業(yè)開發(fā)的熱點。hUCMSC具有特殊的免疫學表型，不表達HLA-Ⅱ類分子和共同刺激分子，不會引起同種異體淋巴細胞增殖反應。移植入宿主體內(nèi)的MSC可避免宿主的免疫排斥反應，通過細胞間的相互作用及旁分泌作用等機制抑制過度活躍的T細胞的增殖及自身免疫反應，從而發(fā)揮免疫重建的功能，進而有可能在自身免疫疾病方面取得較好的療效。南京鼓樓醫(yī)院孫凌云教授將hUCMSC應用于難治性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療，發(fā)現(xiàn)hUCMSC治療安全、耐受，通過糾正患者失衡的免疫系統(tǒng)、減少自身抗體產(chǎn)生，改善病人病情活動度和器官功能，取得了較好的治療效果并能維持較長時間療效［23-29］。但hUCMSC的安全性，尤其干細胞被廣泛關注的致瘤性仍然沒有得到充分研究。本研究通過hUCMSC軟瓊脂克隆以及腫瘤細胞增殖來評價其體外致瘤性，為進一步的體內(nèi)致瘤性研究及臨床應用提供依據(jù)。

表1 hUCMSC共培養(yǎng)對K562細胞增殖的影響

表2 hUCMSC共培養(yǎng)對Colo-205細胞增殖的影響

自臍帶剝離得到的華通氏膠組織塊貼壁培養(yǎng)，長出貼壁細胞鏡下觀察為梭形，與成纖維細胞形態(tài)相似。流式分析表明該方法分離培養(yǎng)的細胞高表達間充質(zhì)干細胞陽性指標CD73、CD90、CD105，低表達血液系統(tǒng)來源細胞表面標志物CD34、CD45、CD19；具有向成脂肪和成骨及成軟骨方向分化的能力，符合ISCT關于間充質(zhì)干細胞的標準［19］。

軟瓊脂克隆實驗的結果可以看出，空白對照組和陰性對照組均無克隆形成，說明試驗無外源性污染，陰性對照細胞MRC-5為正常組織細胞，沒有在阻力培養(yǎng)下生成克隆的能力。陽性對照宮頸癌細胞Hela為腫瘤細胞，增殖能力強，具有阻力培養(yǎng)條件下生成克隆的特性，并隨著時間延長腫瘤細胞克隆增加，說明試驗系統(tǒng)可信。hUCMSC屬于人體正常組織細胞，實驗過程中軟瓊脂培養(yǎng)無細胞克隆形成，證實體外培養(yǎng)時hUCMSC無致瘤性。

hUCMSC分別與人白血病細胞K562和人結腸癌Colo-205細胞體外共培養(yǎng)的促瘤性研究實驗中，和對照組相比，hUCMSC對腫瘤細胞的增殖均無明顯影響，證實體外培養(yǎng)時hUCMSC無促瘤性。

hUCMSC體外培養(yǎng)不具有軟瓊脂克隆形成能力，同時對人白血病細胞K562和人結腸癌Colo-205細胞的增殖無影響，為其進一步體內(nèi)致瘤性研究提供了數(shù)據(jù)，并為其臨床安全使用提供了部分證據(jù)。

關于hUCMSC在動物體內(nèi)的致瘤性及臨床應用的安全性，尚需開展更多的進一步研究。

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（本文編輯:李少婷）

Clony formation capability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell in soft agar and its effects on tumor cell proliferation in vitro

Zeng Guifang， Xie Changfeng，Xu Shaokun， Du Jie， Li Chan， Li Tao， Zuo Conglin， Liu Muyun， Hu Xiang.1Shenzhen Beike Bio-Technology Company Limited， Shenzhen 518062， China；2JOINN Laboratories， Incorporated，Beijing 100176， China
Corresponding author: Liu Muyun， Emai:muyun@beike.cc
Zeng Guifang and Xie Changfeng are the first authors who contributed equally to the article

Objective To study whether human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（hUCMSC）promoted tumor cell growth and formed clones in vitro and to provide safety data for future clinical use. Methods Wharton's jelly was stripped from human umbilical cord and cut into pieces；the adherent cells were collected using tissue explant method and subcultured. The morphology of hUCMSC was observed under microscope. The phenotype of hUCMSC was determined by flow cytometry. The osteogenesis， adipogenesis and chondrogenesis capability were tested by differentiation induction. The clone formation capability was evaluated on soft agar. Cells proliferation was evaluated by proliferation index（PI）through MTT methods after hUCMSC were co-cultured with K562 and colo-205. Results Fibroblasts-like morphology was observed in cells derived from Wharton's jellyof human umbilical cord. The capabilities of osteogenesis， adipogenesis and chondrogenesis differentiation were confirmed. Cells were positive for surface markers of mesenchymal stem cells such as CD73， CD90， CD105 and negative for CD34， CD45 and CD19. These results indicated they were mesenchymal stem cells. Soft agar colony formation assay showed hUCMSC did not exhibit clonal growth. hUCMSC had no effect on tumor cell proliferation when co-cultured with K562 and colo-205 tumor cells in vitro. Conclusion hUCMSCs has neither tumorigenicity nor effects on tumor cell proliferation in vitro.

Umbilical cord； Mesenchymal stem cell； Cells differentiation，；Tumorigenicity； Tumor enhancement

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.005

廣東省科技計劃（2013B070704118）；深圳市科技計劃項目（JSGG20130917151830203、CXZZ20150430152511042）

518062 深圳市北科生物科技有限公司1；100176 北京昭衍新藥研究中心有限公司2

劉沐蕓，Email: muyun@beike.cc

前兩位作者對本文有同等貢獻，均為第一作者

2016-01-11）