李猛 盛宏霞 張斌 陳虎

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·綜述·

臍血來源造血干細胞體外培養(yǎng)擴增技術(shù)研究進展

李猛 盛宏霞 張斌 陳虎

隨著造血干細胞（HSC）移植技術(shù)的發(fā)展，臍血已成為干細胞的主要來源之一。為突破HSC來源及數(shù)量不足的制約，HSC體外擴增技術(shù)發(fā)展迅速，涉及到細胞因子、小分子化合物的應(yīng)用以及聯(lián)合培養(yǎng)及三維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和氧環(huán)境在干細胞擴增技術(shù)的作用以及基因修飾技術(shù)。本文就近年上述技術(shù)中采用的主要方法進行綜述。

造血干細胞； 基因擴增； 臍血

造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）為血液系統(tǒng)中的成體干細胞，能夠通過不斷自我更新長期存在于骨髓中并可多向分化發(fā)育為血液系統(tǒng)中各種細胞類型。HSC移植為治療化療效果不佳及復發(fā)白血病患者最為有效的手段。目前HSC主要來源有骨髓、外周血、臍血及胎盤四種途徑。其中骨髓及動員外周血為造血干細胞移植的主要來源。由于供受者人類白細胞主要抗原（human leukocyte antigen，HLA）的配型限制，很多患者錯失了移植機會，臍血及胎盤來源HSC具有HLA配型相合程度要求低的優(yōu)點，成為HSC移植新的突破點，然而臍血中HSC數(shù)量較少，低數(shù)量的臍血HSC輸注會導致中性粒細胞恢復延遲并增加細菌及病毒感染的風險［1］。而雙份臍血則會帶來移植物抗宿主?。╣raftversus-host disease，GVHD）發(fā)病率增加、血小板恢復時間延長和較高的移植費用等一系列問題［2］，因此研究者一直嘗試應(yīng)用多種方法對HSC（主要針對臍血來源HSC）進行體外擴增培養(yǎng)，以此解決單份臍血中HSC數(shù)量不足的問題。本文依據(jù)近年來國內(nèi)外針對臍血來源的HSC體外擴增技術(shù)的最新進展及效果進行綜述。

一、待擴增造血干細胞的確定與評價標準

欲對HSC進行體外擴增培養(yǎng)的首要步驟是確立待培養(yǎng)細胞的選擇標準，目前對于HSC的判定尚無統(tǒng)一標準，既往各擴增體系多以簡單的免疫表型分析確定并評價擴增效果。大量研究表明在Lin-CD34+CD38-及CD34+CD45RA-細胞中富含造血干細胞，且CD34+CD38-CD45RA-CD90+細胞中含量更高［3］。目前HSC體外擴增評價體系主要通過免疫分型測定擴增后細胞中各組分細胞含量及比例高低。然而Chen等［4］最新研究結(jié)果認為只有HoxB5+細胞才為HSC，依此標準對目前的采納較多的各干細胞評價體系進行了驗證標明，僅有7%～35%的細胞為長時程造血干細胞。除免疫分型測定外，短時程及長時程集落實驗可以用來測定干細胞更新及分化頻率，而通過非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠進行的移植實驗則被認為衡量干細胞擴增效果的金標準。

二、細胞因子擴增HSC技術(shù)

1963年，Ginsburg等［5］發(fā)現(xiàn)在缺乏其他細胞支持下造血細胞無法在體外長期存活，并指出造血細胞的體外培養(yǎng)需要可以調(diào)控細胞形成和發(fā)育的特定物質(zhì)支持。后續(xù)研究表明，處于G0期的HSC的增殖分化過程受到各類抑制或刺激因子相互調(diào)控，這些因子多為造血微環(huán)境及HSC龕產(chǎn)生的分泌蛋白，并在HSC表面擁有相應(yīng)的受體。隨著1967年刺激粒細胞與巨核細胞分化的細胞因子“mashran gm”［后確定并更名為集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）］的發(fā)現(xiàn)，迄今已被發(fā)現(xiàn)的各類因子六十余種，它們分為細胞釋放的可溶性分子或與細胞膜結(jié)合的配體兩類。而依據(jù)其針對HSC生長周期發(fā)育階段的不同，可分為三類:第一類因子主要調(diào)節(jié)HSC從G0期向G1期發(fā)育，如干細胞因子（stem cell factor，SCF）、fms樣酪氨酸激酶3（fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、MP1等；第二類因子可抑制HSC進入G0期，如轉(zhuǎn)化生長因子-β （transforming growth factor β，TGF-β），MIP-1α、p38等；第三類因子主要促進S期HSC擴增，如胰島素生長因子2（insulin growth factor 2，IGF-2）、白介素3（interleukin 3，IL-3）、白介素6（interleukin 6，IL-6）、Notch配體等。

（一）主要細胞因子及其作用機制

各類細胞因子機制尚不完全明確，但目前應(yīng)用最為廣泛，效果最為確切的細胞因子主要包括SCF、TPO、FLT3。

1. SCF:Zsebo等［6］于1990年報道了一種從大鼠肝臟細胞培養(yǎng)基中分離出的新型蛋白，該蛋白促進骨髓干細胞增殖效果較GM-CSF更為有效，其功能區(qū)可與HSC表面酪氨酸激酶受體c-kit結(jié)合，該蛋白命名為SCF。研究表明SCF為間充質(zhì)干細胞分泌的糖蛋白，包括可溶性及跨膜兩種形式，并在體內(nèi)外發(fā)揮不同的作用。只表達可溶性SCF的基因突變小鼠具有嚴重的生殖和造血缺陷，表明膜結(jié)合的形式與體內(nèi)細胞增殖與分化有密切關(guān)系［7］。在體外HSC培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細胞膜表達更多跨膜形式的SCF，且其在支持HSC方面較可溶性SCF更為有效。進一步研究表明SCF在結(jié)構(gòu)上與GMCSF，G-CSF，IL-4，-6，-7，-10，生長激素相似，同為短鏈四螺旋束細胞因子。而在功能上則與血小板衍生生長因子，VEGF，PlGF同為半胱氨酸結(jié)細胞因子［8］。大量實驗表明應(yīng)用SCF進行HSC體外培養(yǎng)可有效減少HSC凋亡，在促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO），G-CSF，F(xiàn)LT3-L或TPO等因子存在狀況下可發(fā)揮增殖刺激作用，但缺乏SCF進行HSC體外擴增其效率明顯下降［9］，其確切的作用使得其幾乎在所有HSC體外擴增細胞因子組合中出現(xiàn)。

2. TPO及其受體:TPO是一種調(diào)節(jié)巨核細胞譜系發(fā)育及血小板生成的特異性細胞因子。近年研究表明，TPO在調(diào)節(jié)HSC增殖分化方面發(fā)揮重要作用:一方面可通過延長HSC細胞周期維持其穩(wěn)定性［10］，另一方面也可促進HSC產(chǎn)生及擴增，并可促進HSC及祖細胞的遷徙及歸巢［11］，其具體機制尚不明確。TPO受體Mpl可在部分造血組織及所有HSC表達，其與TPO結(jié)合后可導致酪氨酸激酶JAKs家族蛋白的磷酸化，進而激活下游（STAT）3，STAT5，Ras/MAPK和PI3K/Akt等轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄因子［12］，從而在HSC產(chǎn)生和增殖中發(fā)揮作用。

3. FLT3及其配體:FLT3為表達于HSC及早期祖細胞表面的Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族成員之一，該類受體家族還包括SCF受體c-kit及M-CSF受體c-fms等。其配體FLT3-L為骨髓胸腺及肝臟產(chǎn)生的具有酪氨酸激酶活性受體的一種細胞因子。體內(nèi)及體外研究均表明FLT3與其配體FLT3-L結(jié)合可影響造血祖細胞和干細胞生長、分化及凋亡，可顯著提高HSC體外培養(yǎng)擴增效率［13］，該作用可與IL-7通過不同細胞通路發(fā)揮協(xié)同刺激作用［14］。最新研究表明FLT3-L可誘導多能祖細胞向髓細胞/淋巴細胞譜系分化而抑制巨核細胞/紅細胞產(chǎn)生［15］。

（二）其他細胞因子

隨著HSC擴增技術(shù)的發(fā)展及細胞因子研究的深入，除上述三種細胞因子外，其他因子也在擴增技術(shù)中得以應(yīng)有并取得一定的效果。

1. Notch配體:Notch信號通路為體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)導通路之一，幾乎涉及所有細胞的增殖及分化過程，其在造血功能激活過程中發(fā)揮重要作用，可通過與HSC及祖細胞表明的受體Notch-1-4結(jié)合調(diào)節(jié)其的生存及增殖過程［16］。HSC龕中表達Notch配體Jagged和Delta，其中Jagged-1配體與Notch-1受體結(jié)合后可發(fā)揮HSC的早期增殖作用，Delta1可刺激臍帶血CD34+陽性細胞Notch信號轉(zhuǎn)導通路從而顯著增加HSC和祖細胞擴增效率［17］。

2. IGF-2及其結(jié)合蛋白:近年來，涉及IGF及其結(jié)合蛋白在HSC增殖分化的研究日益增多，IGF-2特異表達于支持HSC擴增的細胞群中，胎肝及骨髓HSC均表達其受體IGFBP2，多項研究表明IGF 及IGFBP聯(lián)合細胞因子可提高HSC擴增效果［18］，Huynh等［19］指出IGFBP2支持老鼠和人類的HSC體外擴增，并在進一步研究中驗證IGFBP2通過刺激骨髓細胞而非HSC發(fā)揮作用。

3.白介素類細胞因子:白介素類細胞因子家族在HSC擴增中發(fā)揮重要作用，該類因子包括IL-3、4、6、10及11等，其中IL-6作用較為確切，廣泛應(yīng)用于多種細胞因子聯(lián)合培養(yǎng)HSC擴增技術(shù)中，其主要通過JAK/STAT3通路發(fā)揮作用。白介素類細胞因子聯(lián)合其他細胞因子可提高擴增效率，但也有研究表明該類因子可促進HSC分化，影響擴增后細胞的再生潛能［20］。

（三）不同細胞因子聯(lián)合應(yīng)用

研究表明，不同的細胞因子在HSC擴增過程中具有協(xié)同作用，擴增效果高于單細胞因子，且在保持HSC特性基礎(chǔ)上提高造血祖細胞含量，達到較好的移植效率。目前最佳的組合及濃度尚未有定論，但采用最為廣泛的細胞因子組合主要包括SCF、TPO和FLT3-L，研究表明這三種細胞因子組合具有維持造血細胞活力、提高端粒酶活性，以及調(diào)節(jié)粘附分子和促HSC擴增等特性。由于較多的研究選取在ST-HSC仍發(fā)揮重要作用的早期（一般小于10周）進行的移植實驗，因此相關(guān)實驗的SRC水平可能會被高估，這些結(jié)果的可信程度尚需進一步探討。

三、化學分子擴增HSC技術(shù)

近年來，化學合成分子逐漸成為HSC擴增技術(shù)中的越來越重要的工具，其單獨或者與細胞因子聯(lián)合應(yīng)用均可顯著提高擴增效率。而對于這些分子及其與細胞因子協(xié)同作用機制的研究，更有助于我們理解HSC分化擴增的機制。

1.銅離子及其螯合劑:臨床發(fā)現(xiàn)銅離子缺乏患者多伴隨血細胞生成障礙，銅離子作為多種細胞酶的輔因子，在細胞增殖分化過程中發(fā)揮重要作用。銅的含量對于臍血造血干/祖細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，最新研究表明通過高親和力銅離子螯合劑TEPA調(diào)節(jié)銅離子濃度可延遲HSC分化提高增殖活性［21］。Peled等［22］采用TEPA聯(lián)合細胞因子進行的HSC體外擴增效率可達83倍。

2.甲基化酶及組蛋白乙?；敢种苿?DNA甲基化酶及組蛋白脫乙酰酶為調(diào)節(jié)基因表觀遺傳程序表達的組件，可通過干擾DNA甲基化和組蛋白脫乙?；{(diào)節(jié)細胞的功能。首次利用這一原理進行HSC體外擴增的分子為組蛋白乙?；福℉DAC）抑制劑曲古抑菌素A（TSA）和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5azaD），結(jié)果表明其二者聯(lián)合細胞因子可顯著提高HSC進行體外擴增效率［23］，小鼠移植實驗也驗證了擴增后HSC的活性。后續(xù)針對甲基化酶的小分子丙戊酸和賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶G9a/GLP的小分子抑制劑UNC063824的研究均表明其可以有效提高CD34+擴增細胞中的比例。最新研究再次驗證了HDAC抑制劑在HSC擴增技術(shù)中的積極作用，并證實轉(zhuǎn)錄因子SALL4在其中扮演重要角色［25］。近年來關(guān)于沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）非競爭抑制劑煙酰胺（NAM）的研究較多，研究表明NAM可通過抑制SIRT1去乙?；敢种艭D34+分化［26］，最新研究表明NAM聯(lián)合細胞因子可使CD133+擴增效率達72倍［27］。

3.芳香族受體拮抗劑SR1:芳香族受體拮抗劑SR1為嘌呤衍生物，低濃度SR1聯(lián)合細胞因子SCF、FL及IL-6進行的臍血CD34+細胞體外培養(yǎng)實驗顯示，共培養(yǎng)3周及6周后，擴增效率可達669及17 100倍，其中CD34+擴增達50倍［28］。隨后Wagner開展的多項研究也驗證了SR1在HSC擴增中的確切作用，CD34+細胞擴增效率約為328倍［29-30］。雖然利用SR1進行臍血HSC擴增相關(guān)的臨床試驗已經(jīng)開展，但其具體機制目前尚需進一步研究。

4. UM171:UM171是2014利用大型化學庫篩選出的可用于HSC擴增的另一強效小分子，長時程觀察顯示UM171支持長期再生HSC（LT-HSC）擴增，擴增效率強于SR1，而應(yīng)用UM171培養(yǎng)的HSC進行的移植實驗顯示UM171對LT-HSC作用確切，研究顯示UM171并非通過AhR通路發(fā)揮作用，但其機制目前尚不明確，可能與抑制紅系和巨核細胞分化基因相關(guān)［31］。

5.其他化學分子:除此之外，近年來也相繼報道了一些具有HSC擴增能力的其他小分子化合物。天然多芬分子白藜蘆醇［32］和OAC1激活劑Oct4［33］聯(lián)合細胞因子較單用細胞因子HSC培養(yǎng)效率分別增加2和2.8倍，并可促進NSG小鼠HSC植入率。

四、聯(lián)合培養(yǎng)擴增技術(shù)

干細胞龕是干細胞的生長微環(huán)境，由構(gòu)成信號轉(zhuǎn)導的可溶性細胞因子及粘附因子組成。HSC龕在維持HSC自我更新及多向分化中發(fā)揮重要作用［34-35］，隨著HSC研究的深入，HSC龕成為研究的熱點問題。而通過模擬造血微環(huán)境促進HSC體外擴增的技術(shù)也日益成熟。HSC龕中間充質(zhì)干細胞（MSC）對HSC擁有重要的造血支持作用，研究表明MSC可通過直接接觸或分泌內(nèi)源性細胞因子等方式調(diào)控HSC［36］。利用MSC飼養(yǎng)層培養(yǎng)及擴增HSC可避免CD34及CD133分選造成的干細胞數(shù)量減少，增加HSC擴增倍數(shù)，并可促進HSC的歸巢［37］。

五、三維培養(yǎng)系統(tǒng)

傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)及擴增均在相對靜態(tài)封閉的小空間內(nèi)進行，這與體內(nèi)環(huán)境差異較大，隨著科技的發(fā)展，近年來，三維培養(yǎng)技術(shù)得到越來越多關(guān)注。三維培養(yǎng)是指將三維載體與細胞在體外共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)微環(huán)境，并實時清理廢物以給予細胞更好的營養(yǎng)支持，并可穩(wěn)定調(diào)節(jié)各細胞因子及小分子化合物的濃度。三維培養(yǎng)的方式很多，不同方式之間培養(yǎng)效果也存在差異。研究表明采用細胞外基質(zhì)蛋白涂層的三維支架HSC培養(yǎng)單核細胞數(shù)量擴增169倍，其中CD34+CD38-細胞比例達32%［38］，Mousavi［39］進行的實驗表明采用同樣條件進行3D培養(yǎng)和2D培養(yǎng)，CD34+細胞分別擴增40倍和2.6倍。采用攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)模式顯示，不同的攪拌速度可以調(diào)節(jié)干細胞向不同細胞系分化。

六、氧氣對干細胞培養(yǎng)的影響

氧在人體內(nèi)發(fā)揮重要生理作用，各組織氧濃度一般不超過13%，骨髓中氧濃度在1%至7%之間，顯著低于目前細胞體外培養(yǎng)模式大氣中21%氧濃度，研究表明暴露于高氧環(huán)境中不適合HSC正常的增殖分化［40］，Christine等的進一步研究表明8%的氧濃度可以減少HSC向紅系和巨核系分化［41］。未來HSC體外培養(yǎng)及擴增體系中，氧濃度將會發(fā)揮更重要的作用［42］。

表1 目前臨床試驗中的臍血干細胞的體外培養(yǎng)方法

七、基因修飾技術(shù)

基因修飾技術(shù)也被嘗試應(yīng)用于HSC體外擴增中，其涉及的基因主要為HoxB4及SALL4。HoxB4在早期造血細胞中高表達，隨著HSC分化，其表達逐漸下降直至消失，最新研究表明HoxB4通過與OCT4形成OCT4-HoxB5信號通路參與HSC自我更新及造血祖細胞的體外擴增［33］。研究者采用基因修飾技術(shù)利用反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒將HoxB4直接轉(zhuǎn)入造血干細胞中后發(fā)現(xiàn)可顯著提高植入效率。SALL4為鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，SALL4基因過表達的CD34+細胞在體外擴增培養(yǎng)后擴增效率及植入率均顯著增強［43］。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性問題，且有文獻報道高表達HoxB4造血干細胞移植后可增加白血病的發(fā)生幾率［44］，研究者繼而采用間接方法，將HoxB4轉(zhuǎn)入骨髓細胞或間充質(zhì)干細胞中，利用共培養(yǎng)技術(shù)同樣可提高造血干細胞的擴增效率［45］。

八、展望

臨床試驗已經(jīng)驗證了擴增后HSC移植的安全性及有效性（各臨床實驗情況詳見表1［51］），但HSC最佳的擴展條件至今尚沒有明確的共識。隨著科技的進步以及對造血干細胞研究的深入，造血干細胞擴增技術(shù)由既往簡單的提高某種細胞因子濃度向多因素聯(lián)合應(yīng)用發(fā)展，在謀求HSC擴增數(shù)量增加的同時減少對細胞干性的損傷，降低移植后各項風險?，F(xiàn)行體外擴增技術(shù)中，細胞因子仍是最重要的工具，無論是幾種細胞因子聯(lián)合還是與其他小分子聯(lián)合應(yīng)用，或者將細胞因子與其他影響HSC擴增的因素相結(jié)合，幾乎所有成熟的擴增體系中均有細胞因子的參與，而加入細胞因子的時間不同其效果也有不同的改變，未來隨著對各因子機制研究的深入，其在各擴增體系中的應(yīng)用將更為標準化。小分子化合物在提高HSC擴增倍數(shù)以及維持其移植后長期效應(yīng)均有重大突破，但無論是這些小分子自身的細胞毒性，還是基于基因水平的改造對HSC的長期影響，都讓人對于擴增后HSC的安全問題產(chǎn)生質(zhì)疑，尚需進一步觀察驗證。細胞共培養(yǎng)技術(shù)以及對細胞生長適宜氧濃度的探索都將在未來發(fā)揮重要的作用，而三維培養(yǎng)模式隨著技術(shù)的成熟，或許會成為未來HSC擴增技術(shù)的基礎(chǔ)平臺。隨著技術(shù)的迅速進步，我們相信未來HSC擴增技術(shù)在解決臨床HSC數(shù)量不足問題上將有更大的發(fā)展前景。

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（本文編輯:李少婷）

Study progress of ex vivo expansion of human cord blood hematopoietic stem cell

Li Meng，Sheng Hongxia， Zhang Bin， Chen Hu. Department of Hematopoietic Stem Cell Transplantation，the 307 Hospital of Chinese People's Liberation Army， Beijing 100071， China.
Corresponding author:Zhang Bin， Email:zb307ctc@163.com； Chen Hu， Email:chenhu217@ aliyun.com

With the development of hematopoietic stem cell transplantation technology，umbilical cord blood has become one of the main sources of hematopoietic stem cells（HSC）. Significant efforts have gone into developing technologies for ex vivo expansion of HSC in order to overcome the limited number of HSC. A variety of approaches for HSC ex vivo expansion are reviewed in the article， such as cytokine， small molecule compounds， aerobic environment， gene modification technique， co-culture and three-dimensional cell culture technology.

Hematopoietic stem cell； Gene amplification； Fetal blood

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.010

100071 北京，中國人民解放軍三〇七醫(yī)院造血干細胞移植科

張斌，Email:zb307ctc@163.com；陳虎，Email:chenhu217@aliyun.com

2016-01-19）