李　林　聶建軍　張力文　王文菊　張大維　劉　艷　陳　濤

尋常型銀屑病患者外周血中微粒子的表達

李林聶建軍張力文王文菊張大維劉艷陳濤

目的：檢測微粒子在尋常型銀屑病外周血中的表達。方法：高速離心法分離33例尋常型銀屑病患者和33名正常對照外周血T細胞、B細胞及單核細胞來源的微粒子，分別進行細胞特異性單克隆抗體標記，采用流式細胞儀檢測三種細胞來源的微粒子數(shù)量。結(jié)果： 銀屑病組患者血漿中T細胞（CD3+）來源的微粒子、單核細胞（CD14+）來源的微粒子和B細胞（CD19+）來源的微粒子數(shù)量分別為（6.6±0.2）×105，（3.9±0.3）×105和（4.1±0.2）×105高于正常對照組（2.0±0.3）×105、（1.6±0.3）×105和（1.1±0.2）×105。治療后銀屑病組患者微粒子的總數(shù)量較治療前明顯減少（P＜0.01）。此外，銀屑病患者血漿中微粒子水平與PASI評分呈正相關(guān)性。結(jié)論：微粒子的數(shù)量在尋常型銀屑病外周血中明顯升高，可能在銀屑病的發(fā)病中起重要作用。

尋常型銀屑病； 微粒子； PASI評分

微粒子（microparticles，MPs）是細胞在激活、損傷或凋亡狀態(tài)下從質(zhì)膜釋放的直徑＜1 μm的微小囊泡狀物質(zhì)。幾乎所有種類細胞都能產(chǎn)生MPs，常見的有淋巴細胞、單核細胞、血管內(nèi)皮細胞、血小板、胚胎滋養(yǎng)層細胞及腫瘤細胞等，在這些細胞受到激活或者凋亡時MPs的產(chǎn)生顯著增加。MPs擁有其母細胞的特征，含有細胞受體、胞漿蛋白、核酸和細胞因子。MPs曾被認為是細胞塵片，僅僅是細胞活化或損傷的標志物；但現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明MPs能與鄰近或遠處的細胞相互作用，傳遞生物信息，廣泛參與體內(nèi)的病理生理過程，如炎癥反應、血栓形成及腫瘤的增殖等［1，2］。目前已經(jīng)證實，MPs在許多疾病中表達均增加，包括血管炎、系統(tǒng)性硬皮病、皮肌炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、抗磷脂綜合征及多發(fā)性硬化癥等多種自身免疫性疾病，以及急性冠脈綜合征、膿毒血癥、1型糖尿病、HIV等［3，4］。

銀屑病是由遺傳因素、環(huán)境因素共同作用、免疫介導的共同通路引起的角質(zhì)形成細胞過度增殖的一種慢性、復發(fā)性、炎癥性皮膚病，目前病因不清，特征為角質(zhì)形成細胞增殖和分化異常，伴有顯著的炎性細胞浸潤，其中主要為T細胞。角質(zhì)形成細胞增殖和分化調(diào)節(jié)異常、分泌細胞因子和黏附分子的改變及其與T細胞的相互作用等方面在銀屑病的發(fā)病機制中起著重要的作用［5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血中血管內(nèi)皮細胞、血小板及單核巨噬細胞來源的MPs明顯升高，和傳統(tǒng)的心血管代謝危險因子一樣，參與了動脈粥樣硬化的發(fā)病過程［6］。使用抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）藥物改善銀屑病患者癥狀后，其外周血中血管內(nèi)皮細胞和血小板來源的MPs數(shù)量明顯減少［7］。而銀屑病患者外周血中T細胞和B細胞來源的MPs數(shù)量文獻中少有報道，本研究旨在測定銀屑病患者血漿中淋巴細胞和單核細胞來源的微粒子的表達水平，以及不同病情的銀屑病患者體內(nèi)血漿微粒子的表達是否有差異，從一個新的視野和角度進一步探討銀屑病的發(fā)病機制，同時也為治療銀屑病開辟新的道路。

1　材料與方法

1.1病例選擇 經(jīng)成都市第二人民醫(yī)院皮膚科住院部臨床及組織病理確診的33例尋常型銀屑病患者，男20例，女13例，年齡16～65歲，平均（41.8±2.6）歲。初發(fā)或復發(fā)病程1周至40年，平均13.7±2.3年。初診患者或近2個月未系統(tǒng)使用維A酸、免疫抑制劑、激素等藥物，近2周未使用外用藥患者，并且除外妊娠、肝腎功能異常、心腦血管疾病。排除標準:年齡＜16歲或＞65歲；有嚴重心腦血管疾病、肺、肝、腎功能異常者；妊娠及哺乳期女性；近2個月系統(tǒng)使用過維A酸、免疫抑制劑、激素等藥物；近2周內(nèi)使用過外用藥患者。治療方法:予復方甘草酸苷注射液靜脈滴注（60 mL/天），外用鹵米松乳膏及我院自制尿素乳膏（均兩次/天），隔日照射NB-UVB，療程兩周。治療前后分別根據(jù)銀屑病部位、面積、嚴重程度進行PASI評分（psoriasis area and severity index）。對照組:33例年齡、性別相匹配的、無系統(tǒng)性疾病、無吸煙史及無任何皮膚病病史的健康體檢者。兩組研究人員均簽訂書面知情同意書，實驗組治療前后進行PASI評分。兩組性別、年齡差異無顯著性（P＞0.05）。

1.2實驗方法

1.2.1分離微粒子 采清晨空腹受試者靜脈血10 mL，枸櫞酸鈉抗凝，輕輕混勻1500 g離心10 min，取上清液，分裝后液氮中保存。實驗時取4 mL血漿，1500 g離心5 min去除懸浮的細胞，然后100，000 g離心20 min，移除上清液，加入10 mL緩沖液（5 mM KCl，1 mM MgCl2，以及136 mM NaCl，pH 7.4）洗滌兩次［4］。

圖1　尋常型銀屑病患者血漿中T細胞、B細胞及單核細胞來源的微粒子數(shù)量與PASI評分的相關(guān)性

1.2.2標記微粒子和流式細胞計數(shù) 加入2.5 mM CaCl2緩沖液和1%胎牛血清至500 μL，再分別加入FITC、PE及R-PE標記的鼠抗人CD3、CD19、CD14和陰性對照的抗體（Becton Dickinson，Basel，Switzerland），避光孵育30 min。100，000 g離心20 min洗滌兩次，除去未結(jié)合的抗體。最后，各加入200 μL PBS。1.2.3 流式細胞學檢測 用散射光設門（FSC/SSCGating），計算1 min通過的MPs數(shù)量，Cell Quest軟件（美國Becton Dickinson）分析數(shù)據(jù)，打印出散點圖，分別計算CD3、CD19、CD14陽性的MPs數(shù)量，與對照組進行對比，分析與PASI評分的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計學方法 微粒子的數(shù)量用平均數(shù)±SEM表示。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料用t檢驗，MPs和PASI評分之間的相關(guān)性應用Spearmans秩相關(guān)檢驗。數(shù)據(jù)處理分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1尋常型銀屑病患者血漿中微粒子的數(shù)量較正常對照組明顯增加見表1。

表1　兩組血漿中微粒子數(shù)量比較

2.2尋常型銀屑病患者血漿中微粒子的數(shù)量治療后較治療前明顯減少 治療前尋常型銀屑病患者血漿中3種微粒子的平均數(shù)量為（4.91±0.17）×105/mL，治療后尋常型銀屑病患者血漿中3種微粒子的平均數(shù)量為（2.90±0.16）×105/mL，后者較前者明顯減少（t= 16.28，P＜0.01）。其中治療后CD3+、CD14+和CD19+的微粒子數(shù)量較治療前均明顯減少（t分別為11.35、12.67、11.75，均P＜0.01）。

2.3尋常型銀屑病患者的PASI評分與微粒子數(shù)量的相關(guān)性（圖1） 3種細胞來源的微粒子數(shù)量均與銀屑病的PASI評分正相關(guān)，其中T細胞來源的微粒子數(shù)量增加似乎較單核細胞和B細胞來源的微粒子數(shù)量與疾病的嚴重程度更具有相關(guān)性（r=0.76，P＜0.0001）。

3　討論

微粒子早在20世紀60年代由Wolf發(fā)現(xiàn)，長期以來，人們認為其只是血小板的碎片，但近些年人們才發(fā)現(xiàn)幾乎所有的細胞均可產(chǎn)生微粒子［3］。它們在生理和病理過程中作為細胞間信息交換的一種新的媒介，由細胞膜脫落后進入血液循環(huán)，作用于遠隔部位的細胞，介導細胞間的信息交換，傳遞生物信息，廣泛參與體內(nèi)的炎癥反應等病理生理過程。目前的一些研究發(fā)現(xiàn)，微粒子能夠促進白細胞的游走和黏附，還能儲存大量的促炎癥性細胞因子，如IL-1β，誘導細胞因子的產(chǎn)生（IL-6、MCP-1），調(diào)節(jié)B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白。另一方面，微粒子在抗炎癥方面也發(fā)揮著重要作用，T細胞來源的微粒子能夠調(diào)節(jié)TGF-β1的產(chǎn)生，通過FasL途徑誘導B細胞和T細胞的凋亡；一些中性粒細胞來源的微粒子攜帶有annexin A1，通過抑制中性粒細胞和內(nèi)皮細胞的相互作用發(fā)揮抗炎作用。因此微粒子在體內(nèi)的炎癥反應等病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［3］。

由于目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微粒子在多種疾病中表達升高，如血管炎、系統(tǒng)性硬皮病、皮肌炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病，以及冠心病、膿毒血癥、1型糖尿病等，因此我們本次研究嚴格篩選研究對象，任何有以上疾病病史的患者和對照組均被排除在外，以避免對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。目前銀屑病的發(fā)病機制雖仍不完全清楚，但已經(jīng)證實淋巴細胞和單核細胞等炎癥細胞在其發(fā)病中起到至關(guān)重要的作用。淋巴細胞和單核細胞通過分泌多種炎癥性細胞因子，作用于角質(zhì)形成細胞及其他免疫細胞，形成一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，導致并且加重銀屑病的病情。而微粒子由于其來源和作用的廣泛性，極有可能參與了銀屑病的發(fā)病過程。目前雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞、血小板及單核巨噬細胞來源的微粒子數(shù)量在銀屑病患者外周血中明顯升高，但T細胞和B細胞來源的微粒子在銀屑病外周血中的表達水平不十分清楚。因此，在本實驗中我們著重研究銀屑病患者血漿中T細胞（CD3+）、單核細胞（CD14+）和B細胞（CD19+）來源的微粒子。同國外的研究一致，我們發(fā)現(xiàn)單核細胞來源的微粒子數(shù)量較正常對照組明顯升高，另外我們也發(fā)現(xiàn)T細胞來源和B細胞來源的微粒子數(shù)量較對照組也明顯升高，并且治療后3種微粒子數(shù)量較治療前明顯減少。此外，銀屑病患者血漿中T細胞源性微粒子水平與PASI評分具有相關(guān)性，這表明銀屑病的炎癥反應過程中，除了炎癥性細胞因子，如TNF-α等，炎癥細胞來源的微粒子可能同樣起到重要的作用，同時也從另一個角度證實了T細胞在銀屑病發(fā)病中的關(guān)鍵性作用，這是對國外研究的一個補充［8］。然而，同國外的研究一樣，本研究也沒有闡明微粒子在銀屑病中的作用機制。

總之，本研究證實了不同細胞來源的微粒子數(shù)量在尋常型銀屑病患者血漿中明顯增加，其中T細胞來源的微粒子數(shù)量和銀屑病患者的病情嚴重程度相關(guān)。因此，微粒子作為一種細胞間信息交換的媒介參與了銀屑病的發(fā)病過程。然而，微粒子作用的靶點以及在炎癥反應中的作用機制還有待進一步的研究。

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（收稿:2015-08-05 修回:2015-08-27）

Expression of microparticles in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris

LI Lin，NIE Jianjun，ZHANG Liwen，WANG Wenju，ZHANG Dawei，LIU Yan，CHEN Tao.
Department of Dermatology，Chengdu Second People's Hospital，Chengdu 610017，China

Objective:To detect the level of microparticles in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris.Methods:The microparticles from T-cells，B-cells and monocytes in 33 patients with psoriasis vulgaris and 33 healthy controls were isolated by high-speed differential centrifugation.Microparticles from T-cells，B-cells and monocytes were treated with specific labeled monoclonal antibodies respectively and the number of microparticles was detected by flow cytometry.Results:The total number of microparticles derived from T cells，B cells and monocytes in patients was（6.6±0.2）×105，（3.9±0.3）×105and（4.1±0.2）×105and those in healthy controls was（2.0±0.3）×105，（1.6±0.3）×105and（1.1±0.2）×105，with significant difference（P＜0.05）.The number of microparticles in patients decreased after treatment.There was a positive correlation between the level of microparticles and PASI in patients with psoriasis vulgaris.Conclusion:The number of microparticles in patients with psoriasis vulgaris increased significantly，which may play an important role in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；microparticles；PASI

四川省衛(wèi)生廳課題（編號:120553）

成都市第二人民醫(yī)院皮膚科，四川成都，610017