邱冰峰　徐方明　徐湯舟　徐　騏　郗健偉浙江省舟山市舟山醫(yī)院消化科，浙江舟山　316000

膽汁淤積性肝病大鼠肝臟及其膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β的表達(dá)

邱冰峰徐方明徐湯舟徐騏郗健偉
浙江省舟山市舟山醫(yī)院消化科，浙江舟山316000

目的 探究膽汁淤積性肝病大鼠肝臟及其膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的表達(dá)。方法 將60只6～8周齡健康雌性SPF級SD大鼠分為對照組（d0組）、膽總管結(jié)扎術(shù)后7 d組（d7組）、膽總管結(jié)扎術(shù)后14 d組（d14組）及膽總管結(jié)扎術(shù)后21 d組（d21組），各15只，其中d0組大鼠開腹后輕觸膽總管后即關(guān)腹。運(yùn)用Knodell組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)（HAI）評分來評價(jià)各組大鼠肝臟組織學(xué)改變，以PCR方法測量各組大鼠肝臟組織和膽管上皮細(xì)胞中TGF-βmRNA的表達(dá)情況，使用比色法測算細(xì)胞培育后4 d內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的數(shù)量，觀察TGF-β1對膽管上皮細(xì)胞的增殖作用。結(jié)果 肝臟Knodell HAI評分隨著術(shù)后時(shí)間的延長而提高（P＜0.05）；肝臟組織和膽管上皮細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表達(dá)水平隨著膽汁淤積時(shí)間的延長而顯著上調(diào)（P＜0.05）；體外研究顯示，TGF-β1可抑制膽管上皮細(xì)胞增殖。結(jié)論 在膽總管結(jié)扎導(dǎo)致的膽汁淤積性肝病中，肝臟的受損以及TGF-β的mRNA表達(dá)水平也會(huì)隨著膽汁淤積的時(shí)間延長而增加，機(jī)體TGF-β1水平與膽汁淤積性肝病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，隨著增生的膽管上皮細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)增高，膽汁淤積性肝臟纖維化發(fā)生率也會(huì)相應(yīng)增加。［關(guān)鍵詞］膽汁淤積性肝病；膽管上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β

據(jù)研究試驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種同分異構(gòu)體，其細(xì)胞作用機(jī)制與功能可概括為以下幾點(diǎn)：①參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能；②參與機(jī)體正常細(xì)胞增生、分化與凋亡等一系列變化；③對細(xì)胞外基質(zhì)的形成產(chǎn)生一定的刺激作用；④促進(jìn)誘發(fā)組織器官逐漸發(fā)生纖維化［1-3］。膽汁淤積性肝病作為臨床上一類較為常見的消化系統(tǒng)疾病，具有較多的誘發(fā)原因，大量臨床研究資料顯示，該病在發(fā)生發(fā)展期間常伴隨不同程度的肝內(nèi)膽管增生，隨著增生的不斷加重最終可導(dǎo)致膽汁淤積性肝纖維化，從而對肝功能造成不可逆的影響，而此一系列變化都是由TGF-β參與完成的［4-7］。即在膽汁淤積性肝病中，肝內(nèi)膽汁淤積、肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞增生、TGF-β表達(dá)水平上升可以導(dǎo)致肝纖維化，這些病理與生理狀態(tài)之間存在著緊密的聯(lián)系［8-10］。由此可見，在膽管上皮細(xì)胞中高度表達(dá)TGF-β在淤膽性肝病發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。因此，本研究提高制作大鼠肝內(nèi)膽汁淤積的模型及永生化的小鼠膽管上皮細(xì)胞株（immortalized mouse intrahepatic biliary epithelial cell line，mIBEC），探究膽汁淤積性肝病發(fā)展不同時(shí)期膽管上皮細(xì)胞增生與TGF-β表達(dá)之間的關(guān)系，以及TGF-β對膽管上皮細(xì)胞的作用?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下：

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

6～8周齡健康雌性SPF級SD大鼠［購于浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物合格證號：新醫(yī)動(dòng)字（新）syxk2014］60只，體重250～300 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度在18～26℃，相對濕度40%～70%，噪音85 dB以下，氨濃度15.2mg/m3以下，通風(fēng)換氣8～12次/h。所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組15只，每3只一籠，即對照組（d0組）、膽總管結(jié)扎術(shù)后7 d組（d7組）、膽總管結(jié)扎術(shù)后14 d組（d14組）及膽總管結(jié)扎術(shù)后21 d組（d21組），并將d7組、d14組及d21組均記為試驗(yàn)組。

1.2方法

1.2.1模型建立試驗(yàn)組大鼠麻醉后開腹，雙重結(jié)扎膽總管后，斷離膽總管，膽管結(jié)扎動(dòng)物模型即成功建立。對照組大鼠則予開腹后輕觸膽總管后即關(guān)腹。

1.2.2分離肝間質(zhì)細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞分別在術(shù)后的第1、2、3周處死大鼠，包括45只試驗(yàn)組大鼠和15只對照組大鼠。將處死大鼠的部分肝臟取出并置于15%福爾馬林中浸泡，使用5μm切片對肝臟組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)染色，立刻冷凍，提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR （RT-PCR）擴(kuò)增DNA，殘余組織用于分離間質(zhì)細(xì)胞，使用PBS清洗液對膠原酶溶液中的肝細(xì)胞進(jìn)行2次沖洗，之后通過3次離心（50 r/min，3 min）將肝細(xì)胞除去，取上清液二次離心（350 r/min，3 min）得到肝間質(zhì)細(xì)胞。使用高密度梯度法將膽管上皮細(xì)胞從NLPC中分離而出，方法為：在各濃度梯度的Pcoll層放置細(xì)胞懸濁液，并在5℃的環(huán)境下進(jìn)行10 min的離心（3000 r/min），膽管上皮細(xì)胞量即處于1.055～1.065 g/cm3之間。最終得到的膽管上皮細(xì)胞標(biāo)本，一抗為小鼠抗大鼠CK7，二抗為PE結(jié)合的馬抗小鼠IgG多抗，試劑均由Wadecam公司提供，在對膽管上皮細(xì)胞染色完成后，通過流式細(xì)胞學(xué)方法檢測純度。

1.2.3肝臟病理組織學(xué)及免疫組化檢查肝臟切片通過天狼星紅染色后觀察組織結(jié)構(gòu)，并對所有大鼠Knodell組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)（HAI）進(jìn)行評分，根據(jù)病理檢查結(jié)果分別按界面性炎癥及橋接壞死的程度按0～10分評定，匯管周圍無壞死為0分，輕度片狀壞死為1分，中度片狀壞死（累及＜30%匯管周圍）為2分，中度片狀壞死（累及＜50%匯管周圍）為3分，明顯片狀壞死（累及＞50%匯管周圍）為4分，中度片狀壞死+橋狀壞死為5分，明顯片狀壞死+橋狀壞死為6分，多小葉壞死為10分；按小葉內(nèi)肝細(xì)胞變性和壞死的范圍及匯管區(qū)的炎癥狀況分別記分為0～4分，肝小葉內(nèi)無變性和灶性壞死為0分，輕度（嗜酸小體、氣球樣變性和/或＜1/3結(jié)節(jié)中散在的肝細(xì)胞壞死灶）為1分，中度（累及1/3～2/3肝小葉或結(jié)節(jié)為3分，明顯（累及＞2/3肝小葉或結(jié)節(jié)）為4分，匯管區(qū)無炎癥為0分，輕度（＜1/3匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞）為1分，中度（1/3～2/3匯管區(qū)炎癥細(xì)胞增加）為3分，明顯（＞2/3匯管區(qū)炎癥細(xì)胞密度增加）為4分；按纖維化的程度分別記1～4分，無肝纖維化為0分，匯管區(qū)纖維性擴(kuò)大為1分，橋狀纖維連接（匯管區(qū)-匯管區(qū)或匯管區(qū)-中央靜脈連接）為3分，肝硬化為4分［11］。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR從大鼠肝臟以及膽管上皮細(xì)胞中獲取RNA，并將之作為模板通過RT-PCR得到DNA，RNeasy Mini試劑盒由北京方程生物科技有限公司提供。分別自大鼠肝組織及BDEC中提取RNA，以500 ng所提取RNA為模板進(jìn)行RT-PCR獲取cDNA模板。采用QuantiFect SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen），TaqMan ABI PRISM 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）對來自大鼠肝臟組織及不同時(shí)間點(diǎn)的BDEC的cDNA模板進(jìn)行定量擴(kuò)增。在每次PCR擴(kuò)增時(shí)，取相同量的蒸餾水取代模板并當(dāng)作陰性對照，使用GAPDH取代模板的當(dāng)作加樣對照［8］。每個(gè)樣本進(jìn)行3次檢測。

1.2.5TGF-β1對膽管上皮細(xì)胞增殖的作用通過6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)膽管上皮細(xì)胞，并加入TGF-β1和m IBEC培養(yǎng)液（包括DMEM、F12培養(yǎng)液及胎牛血清）一同進(jìn)行孵育，此外將不添加TGF-β1孵育的細(xì)胞作為對照。通過96孔培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)方法與對照確立方法膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)相同，但培養(yǎng)液中需額外加入10 mL/L FBS，使用比色法分別測算細(xì)胞培育后4 d內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的數(shù)量，測定細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞增殖率=（試驗(yàn)后細(xì)胞總量-試驗(yàn)前細(xì)胞總量）/試驗(yàn)前細(xì)胞總量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠Knodell組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)評分比較

肝臟Knodell HAI評分隨著淤膽時(shí)間的延長而增加，d7組、d14組、d21組伴或不伴橋接壞死匯管周圍壞死評分、小葉內(nèi)變性及局灶性壞死評分、匯管區(qū)炎癥評分、纖維化評分及總分均較d0組明顯增高（均P＜0.05），d14組和d21組較d7組伴或不伴橋接壞死匯管周圍壞死評分、小葉內(nèi)變性及局灶性壞死評分、匯管區(qū)炎癥評分、纖維化評分及HAI總分也明顯偏高（均P＜0.05），且d21組HAI各項(xiàng)評分較d14組也明顯偏高（均P＜0.05）。見表1。

表1　各組大鼠Knodell組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)評分比較（分，±s，n=15）

表1　各組大鼠Knodell組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)評分比較（分，±s，n=15）

注：與d0組比較，*P＜0.05；與d7組比較，#P＜0.05；與d14組比較，△P＜0.05

組別伴或不伴橋接壞死的匯管區(qū)周圍壞死小葉內(nèi)變性及局灶性壞死匯管區(qū)炎癥　纖維化　合計(jì)d0組d7組d14組d21組0.2±0.1 2.4±0.5*4.7±1.9*#6.8±1.3*#△0.3±0.1 1.7±0.7*2.6±0.9*#3.1±0.6*#△0.6±0.2 1.4±0.8*2.5±1.3*#3.2±0.7*#△0.2±0.1 1.7±0.9*2.1±1.6*#2.9±0.5*#△0.8±0.3 7.2±2.9*12.9±5.7*#16.0±2.9*#△

2.2各組肝臟組織及膽管上皮細(xì)胞中TGF-βmRNA表達(dá)水平比較

研究結(jié)果顯示，肝臟及膽管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最多的是TGF-β1mRNA，而較少表達(dá)TGF-β2mRNA，而TGF-β3mRNA表達(dá)極其微弱。而隨著膽汁淤積的發(fā)生時(shí)間延長，肝臟組織及膽管上皮細(xì)胞中的TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表達(dá)水平均逐漸增加，d21組、d14組及d7組均顯著高于d0組（P＜0.05），且d21組明顯高于d14組、d7組（P＜0.05），d14組明顯高于d7組（P＜0.05）。見表2～3。

表2　各組肝臟組織中TGF-βm RNA表達(dá)水平比較（±s，n=15）

表2　各組肝臟組織中TGF-βm RNA表達(dá)水平比較（±s，n=15）

注：與d0組比較，*P＜0.05；與d7組比較，#P＜0.05；與d14組比較，△P＜0.05

組別　TGF-β1mRNA　TGF-β2mRNA　TGF-β3mRNA d0組d7組d14組d21組0.09±0.01 0.18±0.03*0.55±0.02*#0.78±0.03*#△0.01±0.01 0.02±0.01*0.11±0.01*#0.19±0.02*#△0.001±0.001 0.002±0.001*0.010±0.001*#0.017±0.010*#△

表3　各組膽管上皮細(xì)胞中TGF-βm RNA表達(dá)水平比較（±s，n=15）

表3　各組膽管上皮細(xì)胞中TGF-βm RNA表達(dá)水平比較（±s，n=15）

注：與d0組比較，*P＜0.05；與d7組比較，#P＜0.05；與d14組比較，△P＜0.05

組別　TGF-β1mRNA　TGF-β2mRNA　TGF-β3mRNA d0組d7組d14組d21組0.50±0.02 0.70±0.03*0.80±0.03*#1.10±0.10*#△0.10±0.01 0.20±0.01*0.70±0.04*#1.00±0.21*#△0.01±0.01 0.10±0.01*0.30±0.02*#1.10±0.15*#△

2.3TGF-β1抑制膽管上皮細(xì)胞的增殖情況

TGF-β1作用后1、2、3、4 d，試驗(yàn)組細(xì)胞增殖率均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4　TGF-β1抑制膽管上皮細(xì)胞的增殖情況（%，±s，n=3）

表4　TGF-β1抑制膽管上皮細(xì)胞的增殖情況（%，±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別　1 d　2 d　3 d　4 d對照組試驗(yàn)組2.6±0.5 1.8±0.4*10.0±1.7 2.0±0.3*6.3±0.8 5.5±0.7*1.3±0.4 1.0±0.2*

3　討論

近些年來，肝臟疾病的許多基礎(chǔ)及臨床研究都取得了很大的進(jìn)步和發(fā)展，隨著經(jīng)濟(jì)生活水平提高以及治療方案的進(jìn)步，其疾病的變化也很大［12-14］。在本次研究中所制作的肝臟膽汁淤積大鼠動(dòng)物模型，其病理特征表現(xiàn)為肝內(nèi)膽汁淤積、膽管增生、纖維間隔形成等一系列狀態(tài)。通過Knodell組織學(xué)評分系統(tǒng)評估膽汁淤積發(fā)生不同時(shí)間肝臟組織學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)肝臟損傷程度可因淤膽時(shí)間的不同造成不同影響，絕大多數(shù)情況均表現(xiàn)為淤膽時(shí)間越長，肝臟損傷程度越重，應(yīng)引起臨床工作者的重視。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽管膽管結(jié)扎術(shù)后第14天內(nèi)出現(xiàn)明顯增殖，且隨著淤膽時(shí)間的延長而加重，與以往研究報(bào)道基本一致［15-18］。

有研究資料顯示，膽管結(jié)扎誘導(dǎo)膽汁淤積性肝病多合并出現(xiàn)不同類型的病理改變，其中以肝內(nèi)膽管增殖作為常見，且隨著疾病的進(jìn)展表現(xiàn)為肝纖維化的加重，出現(xiàn)此類情況的原因是當(dāng)組織損傷后，參與其中的TGF-β存在著長時(shí)間過度表達(dá)，這就在一定程度上促進(jìn)誘導(dǎo)了纖維增生及細(xì)胞外基質(zhì)積聚，從而造成重要器官纖維化，影響其正常的結(jié)構(gòu)與功能，提示TGF-β在肝纖維化發(fā)生中起著重要作用［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)在肝臟發(fā)生纖維化的病變中，膽管上皮細(xì)胞中不僅可見到TGF-β蛋白的增加，同時(shí)可見TGF-βmRNA含量也顯著提升，而此一系列改變與匯管區(qū)組織學(xué)異常變化及纖維化程度存在著明顯的相關(guān)性，但其在正常肝臟組織和膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)較為薄弱，進(jìn)一步證實(shí)了本研究的預(yù)期結(jié)果。此次試驗(yàn)通過制作大鼠膽汁淤積性肝病模型并分時(shí)點(diǎn)檢測大鼠肝臟的病理改變，同時(shí)運(yùn)用Knodell組織學(xué)評分來評價(jià)處理后的肝臟組織學(xué)的改變和膽管上皮細(xì)胞的TGF-β mRNA表達(dá)的具體情況發(fā)現(xiàn)，肝臟Knodell組織評分隨著術(shù)后時(shí)間的延長而提高，肝臟組織和膽管上皮細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表達(dá)水平隨著淤膽時(shí)間的延長而顯著上調(diào)，且大鼠模型顯示，TGF-β可抑制膽管上皮細(xì)胞增殖，此次研究結(jié)果提示了TGF-β表達(dá)上升在淤膽性肝病的發(fā)生發(fā)展中的顯著作用，同時(shí)分離膽管上皮細(xì)胞提示增生的膽管上皮細(xì)胞也可憑借TGF-β表達(dá)上升在淤膽性肝病的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。為以直接的方式證實(shí)TGF-β與膽管上皮細(xì)胞間的互相影響，本研究同時(shí)進(jìn)行膽管上皮細(xì)胞與TGF-β在體外的培養(yǎng)，結(jié)果提示TGF-β對膽管上皮細(xì)胞的增殖起到了抑制效果。

綜上所述，本研究提示TGF-β表達(dá)上調(diào)在該病發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用，增生的膽管上皮細(xì)胞是TGF-β的重要細(xì)胞來源，并顯示了TGF-β在該病肝纖維化形成中的肯定作用。從本研究結(jié)果可以推測出膽汁淤積對膽管結(jié)扎后肝纖維化發(fā)生的影響重大，但其發(fā)病機(jī)制是通過感染還是通過膽鹽潴留等其他因素合并的刺激在起作用，目前還沒有確切的證據(jù)證明這個(gè)機(jī)制，還需要今后進(jìn)一步探討研究。

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Expression of transforming growth factorβin the liver and its biliary epithelial cells of rats with cholestatic liver disease

QIU BingfengXU FangmingXU TangzhouXU Qi XI Jianwei
Department of Gastroenterology，Zhoushan Hospital of Zhoushan City，Zhejiang Province，Zhoushan316000，China

Objective To explore the expression of transforming growth factorβ（TGF-β）in the liver and its biliary epithelial cells of rats with cholestatic liver disease.Methods Sixty healthy female SPF SD rats aged 6-8 weeks were divided into control group（d0group），7 days after common bile duct ligation group（d7group），14 days after common bile duct ligation group（d14group）and 21 days after common bile duct ligation group（d21group），with 15 rats in each group，among which，the common bile duct of d0group was touched softly after laparotomy and then abdomen was closed immediately.Knodell histological activity index（HAI）grading was used to evaluate the hepatic histologic changes of rats，the expression of TGF-βmRNA in liver tissue and biliary epithelial cells was detected by PCR，the amount of biliary epithelial cells within 4 d after cell culture was calculated by colorimetric method，the proliferative effect of TGF-β1for biliary epithelial cells was observed.Results The Knodell HAI scores were improved with the extension of postoperative time（P＜0.05）；the levels ofmRNA expression of TGF-β1，TGF-β2and TGF-β3were increased with the extension of cholestasis time（P＜0.05）；the study in vitro showed that TGF-β1could inhibit the proliferation of biliary epithelial cells.Conclusion In the cholestatic liver disease caused by common bile duct ligation，the liver damage and expression of TGF-βmRNA are increased with the extension of cholestasis time，the level of TGF-β1is closely related to the genesis and development of cholestatic liver disease，with the increase of the expression of TGF-β1in hyperplastic biliary epithelial cells，the incidence of cholestatic hepatic fibrosis will be increased relevantly.

Cholestatic liver disease；Biliary epithelial cells；Transforming growth factorβ

R575

A

1673-7210（2016）01（c）-0027-04

2015-10-14本文編輯：張瑜杰）

浙江省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010KY B086）；浙江省教育廳高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目（Y200908063）。

邱冰峰（1971-），男，博士，副主任醫(yī)師；研究方向：肝纖維化發(fā)病機(jī)制及臨床診治。