高浩然　佟德惠　黃澤清　高巋然遼寧省腫瘤醫(yī)院麻醉科，遼寧沈陽(yáng)　110042

RECK、MMP-14及VEGF在喉癌中的表達(dá)及臨床意義

高浩然佟德惠黃澤清高巋然
遼寧省腫瘤醫(yī)院麻醉科，遼寧沈陽(yáng)110042

目的 探討RECK、MMP-14及VEGF在喉癌中的表達(dá)情況及臨床意義。 方法 選擇2013年8月～2015年1月遼寧省腫瘤醫(yī)院選手術(shù)治療的喉癌患者41例，分別取其喉癌組織和癌旁組織，另取喉息肉行手術(shù)切除患者的息肉組織作為對(duì)照。分別采用Realtime-PCR和Western blot檢測(cè)各組織中RECK、MMP-14及VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)情況，分析其與喉癌臨床病理特征的相關(guān)性。 結(jié)果MMP-14和VEGF在喉癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織及息肉組織（P＜0.05），且其表達(dá)與病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)（P＜0.05）；RECK喉癌組織的表達(dá)低于癌旁和息肉組織，其與MMP-14（r=-0.812，P=0.027）和VEGF（r=-0.907，P=0.013）呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論聯(lián)合檢測(cè)RECK、MMP14和VEGF基因?qū)戆┗颊叩脑\斷、轉(zhuǎn)移及臨床分期的確定具有重要意義。

喉癌；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；基質(zhì)金屬蛋白酶-14；轉(zhuǎn)移

喉癌源于喉上皮，是頭頸部發(fā)病率第二高的惡性腫瘤，具有高度的侵入性和轉(zhuǎn)移性，其發(fā)生發(fā)展涉及多種因素和多個(gè)步驟［1-2］?；|(zhì)金屬蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14，MMP-14）是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族的重要成員之一［3］，參與家族中其他MMPs的激活，起到降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的作用，同時(shí)在胃癌、乳腺癌和食管癌等眾多癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［4-5］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，在腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤再生中發(fā)揮重要作用［6］。RECK （reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK）基因是一種新型腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因和MMPs抑制劑，已報(bào)道RECK對(duì)MMP-14和MMP-2等多種MMPs家族成員有抑制作用，該作用可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)展及侵襲［7-8］。本研究通過采用Realtime-PCR和Western blot檢測(cè)喉癌患者組織中RECK，MMP-14和VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析其與喉癌臨床病理特征的相關(guān)性，為喉癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判斷提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為其機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年8月～2015年1月于遼寧省腫瘤醫(yī)院手術(shù)治療的喉癌患者41例，其中男29例，女12例，年齡45～81歲，患者術(shù)前均無(wú)放療、化療及其他免疫治療經(jīng)歷，簽署知情同意書，在術(shù)中分別取喉癌組織和癌旁組織；此外，在此期間選取15例喉息肉行手術(shù)切除患者的息肉組織作為對(duì)照，分別將上述組織置液氮中保存。

1.2主要試劑與儀器

RECK、MMP-14、VEGF引物由北京華大基因公司合成；熒光定量PCR試劑盒為TAKARA公司產(chǎn)品；RECK、MMP-14、VEGF抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ABI 7500 Real-Time PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；垂直板電泳、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)BIO-RID公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1RECK，MMP-14 and VEGF mRNA檢測(cè)根據(jù)GenBank中報(bào)道的RECK、MMP-14、VEGF基因序列，應(yīng)用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)引物（表1）；液氮罐中取出保存的組織樣本，約100mg加入1mL Trizol，迅速研磨成勻漿液，采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄至cDNA，用Syber Green熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒配伍反應(yīng)體系（R.T.product1μL、SYBRPremix Ex TaqⅡ10μL、Primer 1 1μL、Primer 2 1μL、H2O 7μL），放置熒光定量PCR儀中，設(shè)置PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃2 min，95℃30 s，60℃30 s收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。

表1　引物序列

1.3.2RECK、MMP-14、VEGF蛋白檢測(cè)采用Western blot法檢測(cè)各組織樣本RECK，MMP-14和VEGF表達(dá)水平。從液氮中取組織樣本，稱取100mg，加1mLRIPA 和10μLPMSF混合液，研磨制成乳懸液，12 000 r/min離心10 min，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加上樣緩沖液，沸水煮5min后行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加兔抗人RECK，MMP-14和VEGF抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，15min/次；ECL發(fā)光法試劑盒顯色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RECK、MMP-14、VEGFmRNA檢測(cè)

RECK、MMP-14及VEGFmRNA檢測(cè)結(jié)果見圖1，RECK基因在喉癌組織中的表達(dá)量低于喉息肉組織和癌旁組織（P＜0.05）；與喉息肉組織和癌旁組織比較，喉癌組織中MMP-14和VEGF基因的表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。

圖1　RECK、MMP-14、VEGFm RNA檢測(cè)

2.2RECK、MMP-14、VEGF蛋白檢測(cè)

Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖2，RECK蛋白在喉癌組織中的表達(dá)量低于喉息肉組織和癌旁組織 （P＜0.05）；與喉息肉組織和癌旁組織比較，喉癌組織中MMP-14和VEGF蛋白的表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），RECK、VEGF和MMP-14蛋白在喉息肉組織與癌旁組織中的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2　RECK、MMP-14、VEGF蛋白檢測(cè)

2.3RECK、MMP-14及VEGF蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

分析喉癌組織中RECK、MMP-14及VEGF蛋白在不同年齡、性別、病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期中的表達(dá)量具體見表2，RECK、MMP-14和VEGF的蛋白表達(dá)與病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān) （P＜0.05），與年齡、性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

表2　RECK、MMP-14及VEGF蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系（±s）

表2　RECK、MMP-14及VEGF蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系（±s）

注：VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；MMP-14：基質(zhì)金屬蛋白酶14

項(xiàng)目　例數(shù)　RECK　P值　VEGF　P值年齡≤62歲＞62歲性別0.9800.920 MMP-14　P值0.970 22 19 0.94±0.05 0.86±0.03 1.71±0.24 1.80±0.19 1.73±0.18 1.79±0.13 0.9100.7200.750男女29 12 0.94±0.09 0.93±0.05 1.73±0.18 1.61±0.13 1.77±0.16 1.68±0.11病理分級(jí)0.0150.0120.011 G1 G2 G3 15 20 6 1.05±0.14 0.96±0.13 0.23±0.08 1.51±0.17 1.71±0.14 1.93±0.21 1.58±0.16 1.75±0.12 1.91±0.17淋巴轉(zhuǎn)移0.0340.0140.015有無(wú)13 28 0.64±0.09 1.28±0.15 1.89±0.29 1.61±0.14 1.92±0.21 1.65±0.18臨床分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ、Ⅳ期0.0210.0160.014 16 25 1.12±0.14 0.76±0.07 1.54±0.14 1.93±0.11 1.55±0.18 1.90±0.15

2.4相關(guān)性分析

RECK與VEGF mRNA在喉癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.907，P=0.013）；RECK與MMP-14 mRNA在喉癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) （r=-0.812，P= 0.027）；VEGF與MMP-14 mRNA在喉癌組織中的表達(dá)量有顯著的線性相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)為0.698，線性方程為Y=0.00561+0965X（圖3）。

圖3　喉癌組織中VEGF和MMP-14蛋白的相關(guān)性

3　討論

細(xì)胞外基質(zhì)是癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移及微轉(zhuǎn)移過程中面臨的第一道屏障，MMPs在細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制相關(guān)，是近年來(lái)研究較多的酶類。MMP-14位于細(xì)胞表面，屬于MMPs家族中的一種特殊酶類，可降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。研究表明，MMP-14能夠以可溶形式分泌在細(xì)胞外，降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，可通過MMP-2的激活，阻擋腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)［9-10］。MMP-14的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，可以促進(jìn)血管再生，在腫瘤血管生成過程發(fā)揮重要作用［11］。Chaffe等［12］用Realtime-PCR在膀胱癌中檢測(cè)出MMP-14 mRNA的高表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Wu等［13］將MMP-14轉(zhuǎn)染SW 626細(xì)胞系，結(jié)果癌細(xì)胞增值和侵襲能力得到抑制。本研究結(jié)果表明，MMP-14在喉癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)量與與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。綜上推測(cè)MMP-14在腫瘤的侵襲中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

VEGF分裂能力較強(qiáng)，可以加速腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)新生腫瘤血管的形成，增加了血管通透性，為腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件，是腫瘤形成的必要途徑。研究表明，VEGF在膽管癌、大腸癌、卵巢癌、大腸癌、胃癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等組織中表達(dá)量明顯高于癌旁組織［14-17］。在本研究中，喉癌組織中VEGF的表達(dá)亦高于癌旁組織，且其表達(dá)量與病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，提示VEGF蛋白可在喉癌診斷及治療方案中發(fā)揮作用，其具備評(píng)估喉癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛能。

RECK基因是MMPs的抑制劑，可有效抑制MMP-2，MMP-4和MMP-14等MMPs家族成員的表達(dá)，在抑制腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用［18-20］。Kumamot等［21］研究結(jié)果表明，RECK基因的表達(dá)與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，其腫瘤的惡性程度越高，RECK的表達(dá)量越低。本研究中癌旁組織和喉息肉組織中RECK mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯高于癌組織（P＜0.05），且其表達(dá)量與MMP-14和VEGF呈負(fù)相關(guān)，與病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，提示RECK基因可以抑制MMP-14 和VEGF的表達(dá)，其在抑制喉癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，喉癌組織中MMP-14和VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)量升高，RECK基因的表達(dá)量降低，聯(lián)合檢測(cè)MMP-14、VEGF和RECK基因?qū)戆┑脑\斷、臨床分期的判斷、喉癌侵襲具有重要意義，可作為判斷喉癌生物學(xué)行為的重要參考指標(biāo)；此外，這3種基因的同時(shí)檢測(cè)并進(jìn)一步深入研究，將有助于找到治療喉癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)，為開發(fā)抗腫瘤藥物和分子靶向治療提供新選擇。

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Expression and clinical significance of RECK，MMP-14 and VEGF protein in laryngeal carcinoma

GAO HaoranTONG Dehui HUANG Zeqing GAO Kuiran
Department of Anesthesiology，Tumor Hospital of Liaoning Province，Shenyang110042，China

Objective To investigate expression and clinical significance of RECK，MMP-14 and VEGF in laryngeal carcinoma.Methods From August 2013 to January 2015，in Tumor Hospital of Liaoning Province，41 patients with laryngeal cancer and underwent surgical treatment were selected，the throat cancer tissue and para-carcinoma tissue were collected respectively，at the same time，polypus tissue from 15 patients with laryngeal polypus were collected as control.Realtime-PCR and Western blot were used to detect the organisations of RECK，MMP-14 and VEGFmRNA and protein expression respectively，the correlation of they and clinical pathological features of laryngeal cancer was analyzed.Results The expression of MMP-14 and VEGF in laryngeal carcinoma was significantly higher than those in para-carcinoma tissue and polypus tissue（P＜0.05），and their expression were related with pathological grading，lymphatic metastasis and clinical stages（P＜0.05）；the expression of RECK in laryngeal carcinoma was significantly lower than those in para-carcinoma tissue and polypus tissue（P＜0.05），and itwas negatively related with MMP-14（r=-0.812，P=0.027）and VEGF（r=-0.907，P=0.013）.Conclusion The joint detection of RECK，MMP14 and VEGF genes has determining significance on diagnosis，metastasis and clinical stage for patients with laryngeal cancer.

Laryngeal；Vascular endothelial growth factor；Matrix metalloproteinase 14；Metastasis

R736.1

A

1673-7210（2016）01（b）-0085-04

2015-09-06本文編輯：蘇暢）

高浩然（1971.9-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：腫瘤麻醉學(xué)。

高巋然（1969.3-），女，博士，主任醫(yī)師；研究方向：腫瘤的影像學(xué)診斷。