林培紅　胡繼芬福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建福州　350009

子癇前期患者胎盤組織中HSP70和NF-κB的表達(dá)及意義

林培紅胡繼芬
福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建福州350009

目的 探討子癇前期患者胎盤組織中HSP70和NF-κB的表達(dá)差異及意義。方法 選取2013年12月～2015年1月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院住院分娩的65例孕婦為研究對象，其中正常妊娠25例（正常妊娠組），輕度子癇前期17例（輕度子癇前期組），重度子癇前期23例（重度子癇前期組）。采用免疫組化法及實(shí)時熒光定量PCR檢測孕婦胎盤HSP70和NF-κB的表達(dá)，并分析HSP70與NF-κB的相關(guān)性。 結(jié)果 免疫組化結(jié)果提示：HSP70及NF-κB在正常妊娠組、輕度子癇前期組及重度子癇前期組患者胎盤組織中的染色程度依次增高，輕度及重度子癇前期組HSP70及NF-κB陽性表達(dá)率與正常妊娠組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但輕度及重度子癇前期組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果提示：與正常妊娠組比較，HSP70及NF-κB在輕度子癇前期組及輕度子癇前期組中的表達(dá)水平增高，輕度子癇前期組及重度子癇前期組與正常妊娠組兩兩比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HSP70與NF-κB呈正相關(guān)（r=0.692，P＜0.01）。結(jié)論 子癇前期患者胎盤組織中HSP70和NF-κB表達(dá)增加，可能與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

子癇前期；胎盤組織；熱休克蛋白70；核因子-κB

子癇前期是妊娠期特發(fā)疾病，發(fā)生率為2%～6%［1］，可引起母嬰不良結(jié)局［2］，其發(fā)病機(jī)制是產(chǎn)科探討研究的熱點(diǎn)。目前主要觀點(diǎn)有：遺傳易感、免疫機(jī)制、胎盤缺血及缺氧、營養(yǎng)缺乏、胰島素抵抗、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子的異常表達(dá)、基因突變或基因多態(tài)性等［3-6］。熱休克蛋白70（HSP70）和核因子-κB（NF-κB）在胚胎著床和發(fā)育、調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能方面、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等均有一定的作用，提示其可能與子癇前期發(fā)病密切相關(guān)。本課題擬采用免疫組化方法及RTPCR（實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法檢測子癇前期和正常妊娠婦女胎盤HSP70與NF-κB表達(dá)情況，探討二者的變化及與子癇前期的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年12月～2015年1月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院住院并分娩病例65例，其中正常妊娠組25例；子癇前期組40例，其中包括輕度子癇前期組17例，重度子癇前期組23例。研究對象年齡、終止妊娠孕齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。子癇前期的診斷參考謝幸及茍文麗主編的第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》［7］。所有產(chǎn)婦均為單胎妊娠，排除其他產(chǎn)科并發(fā)癥及合并癥。本研究已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，參與者均知情同意。

表1　三組研究對象相關(guān)臨床資料比較（±s）

表1　三組研究對象相關(guān)臨床資料比較（±s）

組別　例數(shù)　年齡（歲）　孕齡（周）正常妊娠組輕度子癇前期組重度子癇前期組P值25 17 23 27.9±4.05 25.4±6.60 29.6±5.65 ＞0.05 38.94±1.49 38.59±1.45 38.02±1.67 ＞0.05

1.2方法

1.2.1取材胎盤娩出后，立即取胎盤臍帶附著處母體面的全層胎盤組織2塊，無菌下生理鹽水反復(fù)漂洗吸干，其中一塊固定于10%中性多聚甲醛溶液，脫水后石蠟包埋。另一塊取約100mg置入凍存管保存于液氮。

1.2.2HSP70蛋白檢測免疫組化采用MaxVisionTM一步法，兔抗人HSP70多克隆抗體及兔抗人NF-κB p65多克隆體，為英國Abcam公司生產(chǎn)。MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野得分取平均值統(tǒng)計。結(jié)果判定按半定量法，①染色強(qiáng)度分級評分：細(xì)胞內(nèi)無著染色、著色不清、與背景一致為0分；見少量淡黃色顆粒，高于背景為1分；見較多深棕色顆粒為2分；見大量棕黃色或棕褐色顆粒為3分。②陽性細(xì)胞百分率評分：無陽性細(xì)胞為0分；＜25%為1分；25%～50%為2分；＞50%為3分。取以上兩項(xiàng)乘積：積分0～3分為（-）；4～9分為（+）。

1.2.3RT-PCR檢測NF-κB p65表達(dá)采用Trizol法提取總RNA。將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（互補(bǔ)脫氧核糖核酸），然后設(shè)計特異性引物和Sybr Greenl熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR檢測。設(shè)置β-actin為內(nèi)參照。PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置：94℃4 min，94℃20 s，60℃30 s，72℃30 s，循環(huán)35次，72℃檢測信號。引物分別為：HSP70：正義鏈：5’-CAGAACACCGTGTTTGACGC-3’，反義鏈：5-CTCCTCGGGGTAGAATGCC-3’；NF-κB p65：正義鏈：5’-GTGGGGACTACGACCTGAATG-3’，反義鏈：5’-GCACGATTGTCAAAGATGGGA-3’；內(nèi)參β-actin：正義鏈：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，反義鏈：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，以上引物均為上海閃晶分子生物科技有限公司設(shè)計合成，經(jīng)Genebank檢索為特異性引物。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)HSP70 mRNA、NF-κB p65 mRNA的Real-Time PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線。利用ABI 7300系統(tǒng)進(jìn)行分析，采用2-△Ct法計算目的基因在每個模板中的平均相對含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)關(guān)系采用直線相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果

2.1.1HSP70在胎盤組織中的表達(dá)HSP70主要定位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿，部分核著色。輕度子癇前期組表達(dá)細(xì)胞數(shù)增加，陽性顆粒增多，著色加深；重度子癇前期組染色進(jìn)一步加深。統(tǒng)計分析提示：正常妊娠組、輕度子癇前期組及重度子癇前期組患者染色程度依次增高，輕度及重度子癇前期組陽性表達(dá)率與正常妊娠組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但輕度子癇前期組與重度子癇前期組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

2.1.2NF-κB p65在胎盤組織中的表達(dá)NF-κB p65主要定位于胎盤的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮的細(xì)胞漿和細(xì)胞核。正常妊娠組可見少量陽性細(xì)胞，主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿，胞核內(nèi)極少；輕度子癇前期組陽性顆粒明顯增多，著色加深，胞核內(nèi)表達(dá)明顯增加；重度子癇前期組染色進(jìn)一步加深，大部分合體滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿均有表達(dá)，胞核內(nèi)表達(dá)進(jìn)一步增加。統(tǒng)計分析提示：正常妊娠組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組染色程度依次增高，輕度子癇前期組及重度子癇前期組與正常妊娠組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但輕度子癇前期組與重度子癇前期組患者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

圖1　HSP70在胎盤組織中的表達(dá)（免疫組化,400×）

圖2　NF-κB p65在胎盤組織中的表達(dá)（免疫組化,400×）

表2　　各組胎盤組織中HSP70與NF-κB p65表達(dá)水平比較（例）

2.2RT-PCR結(jié)果

2.2.1HSP70mRNA及NF-κB p65mRNA表達(dá)情況 正常妊娠組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組HSP70 mRNA及NF-κB p65mRNA逐漸升高，且組間兩兩比較差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

2.2.2HSP70 mRNA與NF-κB p65 mRNA相關(guān)性分析HSP70mRNA的表達(dá)與NF-κB p65 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.692，P＜0.01）。

表3　各組胎盤組織中HSP70 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達(dá)情況比較

3　討論

HSP是指熱休克反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄合成的一組蛋白，在各種不利于自身的因素刺激下，均可誘導(dǎo)細(xì)胞快速翻譯合成，啟動內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，發(fā)揮抗損傷的應(yīng)激保護(hù)效應(yīng)［8-9］。根據(jù)其分子量大小的不同，HSP可分為：HSP27及泛素、HSP60家族、HSP70家族、HSP90家族和 HSP110家族［10］，其中HSP70是最保守、含量最豐富的一類，可誘導(dǎo)性最強(qiáng)。人類發(fā)生應(yīng)激時主要合成HSP70。子癇前期胎盤缺血缺氧，導(dǎo)致生成的活性氧增加，促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)變性損傷，激活熱休克反應(yīng)［11］。此時，HSP70作為分子伴侶，可保護(hù)多肽的結(jié)構(gòu)和功能。HSP70的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制可能是：①穩(wěn)定細(xì)胞膜：HSP70可與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，穩(wěn)定質(zhì)膜，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的正常。②抗氧化作用：通過抑制NADPH氧化酶的功能，減少氧自基的產(chǎn)生，同時促進(jìn)內(nèi)源性過氧化酶的表達(dá)，清除氧自由基，對抗氧化應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞［12］。③增加正常蛋白的合成：HSP70與ATP高度親和，水解ATP所釋放的能量能幫助細(xì)胞合成正常的蛋白，促進(jìn)蛋白損傷的修復(fù)，清除變性、無法修復(fù)的蛋白，恢復(fù)受損核仁的結(jié)構(gòu)［13-14］。④分子伴侶：HSP70有助于蛋白質(zhì)的正確折疊。⑤抑制凋亡：HSP70可直接抑制促細(xì)胞凋亡蛋白的功能，從而抑制細(xì)胞凋亡［15］，減輕子癇前期時器官損傷。但是HSP70的表達(dá)增加并不能完全阻止子癇前期病情的發(fā)生和進(jìn)展，Shall等［16］研究發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓疾病患者胎盤細(xì)胞HSP70的過度表達(dá)并不能提高其抗凋亡能力，反而造成細(xì)胞線粒體通透性增加，加速細(xì)胞凋亡。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于各種類型的組織和細(xì)胞，在細(xì)胞受到刺激時可被誘導(dǎo)激活，繼而激活多種重要前炎癥因子，使之轉(zhuǎn)錄活化。有活性的NF-κB以二聚體形式存在，最常見的是p50和p65的異二聚體。測定NF-κB p65的表達(dá)可代表NF-κB的活化程度。在炎癥和氧化應(yīng)激的刺激下NF-κB活化，活化的NF-κB可使表皮生長因子、血小板生長因子等生長因子高表達(dá)，傳遞引起平滑肌細(xì)胞增殖、血管重建的膜內(nèi)信號，從而使細(xì)小動脈膠原纖維、管壁厚度、平均動脈壓增加，導(dǎo)致高血壓、蛋白尿等一系列子癇前期的癥狀［17-20］。有研究亦發(fā)現(xiàn)重度子癇前期患者胎盤組織中NF-κB表達(dá)增加［21-22］。

本研究結(jié)果顯示，HSP70、NF-κB在子癇前期胎盤組織中具有相關(guān)性，呈正相關(guān)改變，提示兩者均參與了子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。HSP70作為子癇前期的內(nèi)源性保護(hù)分子之一，NF-κB作為子癇前期級聯(lián)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可研究如何從基因角度上抑制NF-κB的激活及有效地誘導(dǎo)HSP70生成，作為子癇前期預(yù)防和治療的新手段，這也將為臨床提供不同的治療思路及途徑。

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Expression of HSP70 and NF-κB in the placental trophoblasts of pregnant women com plicated with preeclampsia

LIN PeihongHU Jifen
Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)ujian Province，F(xiàn)uzhou350009，China

Objective To investigate the difference and significance between the expression of HSP70 and NF-κB in the placenta tissues of normal pregnancy and preeclampsia patients，in order to find out the relation between HSP70 and NF-κB.Methods From December 2013 to January 2015，65 pregnant patients in the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University were selected.There were 25 healthy pregnant women（normal pregnant group），17 mild preeclampsia patients（mild preeclampsia group）and 23 severe preeclampsia patients（severe preeclampsia group）.The expressions of HSP70 and NF-κB in the placental tissues were measured using immunohistochemistry methods and real-time fluorescence quantitative PCR technique.Results HSP70 and NF-κB immunohistochemical results suggested that the staining degree of the normal pregnant group，the mild and severe preeclampsia group increased gradually.The differences of the expressions of HSP70 and NF-κB between the mild，severe preeclampsia group and the normal pregnant group were significant（P＜0.01），while there was no statistical difference between the mild preeclampsia group and the severe preeclampsia group（P＞0.05）；the results of HSP70 and NF-κB real-time fluorescence quantitative PCR suggested that，the level of the expression increased in mild preeclampsia group and severe preeclampsia group，as compared with the normal pregnant group，the difference between the mild preeclampsia group，severe preeclampsia group and the normal pregnant group was statistically significant（P＜0.01）.The results of correlation analysis showed that，the expression of HSP70 was positively correlated with NF-κB（r=0.692，P＜0.01）.Conclusion The expression of HSP70 and NF-κB increases in placental tissues of patients with preeclampsia，and may be associated with the occurrence and development of preeclampsia.

Preeclampsia；Placenta tissue；Heat shock protein 70；Nuclear factorκB

R714.246

A

1673-7210（2016）01（b）-0061-04

2015-10-18本文編輯：任念）

福建省福州市科技計劃項(xiàng)目（2014-S-136-6）。

胡繼芬（1958-），女，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師；研究方向：圍生醫(yī)學(xué)。