高麗麗　唐詠春　毛德軍　邢　巖.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬海慈醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東青島　266000；2.中國醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京　0002

外周血中鈣調(diào)蛋白對阿爾茨海默病的診斷價值

高麗麗1唐詠春1毛德軍1邢巖2▲
1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬海慈醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東青島266000；
2.中國醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京100012

目的 檢測阿爾茨海默?。ˋD）患者外周血單個核細(xì)胞和血漿中鈣調(diào)蛋白（CaM）的表達(dá)水平，評價其作為AD生物標(biāo)志物的診斷價值。方法 將2013年2月～2015年1月于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬海慈醫(yī)院就診和體檢的對象共116例納入本研究，包括AD患者40例、輕度認(rèn)知障礙（MCI）患者20例、帕金森?。≒D）患者20例、額顳葉癡呆（FTD）患者10例、路易體癡呆（DLB）患者10例、進(jìn)行性核上性麻痹（PSP）患者6例、認(rèn)知正常的健康體檢者（對照組）10名。取外周血分離單個核細(xì)胞和血漿，采用Western blot和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測CaM在外周血單個核細(xì)胞和血漿中的表達(dá)水平，并通過繪制ROC曲線判斷其診斷能力。 結(jié)果AD患者外周血單個核細(xì)胞和血漿中CaM的表達(dá)水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且CaM的表達(dá)水平不隨AD的進(jìn)展變化。以對照組和PSP、DLB、FTD、PD患者中CaM的表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線，曲線下面積分別為0.958、0.946、0.846、0.958和0.896。結(jié)論CaM在AD患者外周血單個核細(xì)胞和血漿中高表達(dá)，是一種潛在的AD生物標(biāo)志物。

阿爾茨海默病；鈣調(diào)蛋白；外周血；生物標(biāo)志物；診斷價值

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，患者大腦內(nèi)形成淀粉樣蛋白斑，乙酰膽堿能神經(jīng)元大量死亡［1-2］。一系列臨床研究和尸檢報道顯示，AD的病理學(xué)改變往往在發(fā)病早期已經(jīng)出現(xiàn)，但目前AD的診斷耗時較長，需要進(jìn)行一系列的臨床診斷、心理學(xué)測試及影像學(xué)檢測，且需要排除其他神經(jīng)系統(tǒng)性疾病［3-4］。目前現(xiàn)有的生物標(biāo)志物存在取樣困難、特異性低等缺點［5-6］。Solomon等［7］通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）在死亡的AD患者腦組織中表達(dá)較低，但其是否在AD患者外周血中存在表達(dá)異常目前并不清楚。本研究通過比較AD患者和其他幾種癡呆患者血液中CaM的表達(dá)水平，評價CaM作為AD生物標(biāo)志物的潛能，為AD的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2013年2月～2015年1月于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬海慈醫(yī)院就診和查體的AD患者40例（符合美國國家衰老研究所和阿爾茨海默病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)），并根據(jù)患者疾病的進(jìn)展情況分為輕度20例、中度12例和重度8例，輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment，MCI）患者20例［符合Petersen的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床癡呆程度評定量表（CDR）評分等于0.5］，帕金森?。≒arkinson disease，PD）患者20例（符合1984年全國錐體外系疾病討論會關(guān)于《帕金森病及帕金森綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)和鑒別診斷》），額顳葉癡呆 （frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）患者10例（符合1998年額顳葉癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)），路易體癡呆 （dementia with Lewy bodies，DLB）患者10例（符合2005年修訂的DLB統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)），進(jìn)行性核上性麻痹患者（progressive supranuclear palsy，PSP）6例（符合NINDS-SPSP標(biāo)準(zhǔn)），認(rèn)知正常的健康體檢者10名（對照組）。排除有認(rèn)知障礙家族史、頭顱外傷史的患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象知情并同意。研究對象的一般資料經(jīng)分析比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1　研究對象的一般資料

1.2方法

對各個研究對象進(jìn)行常規(guī)取血，一部分血液經(jīng)過離心分離血漿，另一部分用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞。分離出的淋巴細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后用含10%胎牛血清（FBS）的1640培養(yǎng)基按照2× 106個/mL的濃度接種于培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h。收集淋巴細(xì)胞，PBS清洗后加入TritonX-100裂解緩沖液充分裂解細(xì)胞，BCA試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）測定蛋白質(zhì)濃度。對蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉封閉，加入小鼠抗人鈣調(diào)蛋白抗體（1∶1500，購自艾美捷科技有限公司）和抗β-actin抗體（1∶1500，購自艾美捷科技有限公司）4℃過夜后，加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（碧云天）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測，Image J檢測蛋白條帶密度。血漿中CaM的水平用人鈣調(diào)蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（購自上海士鋒生物科技有限公司）測定。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件分析實驗中得到的數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用方差分析，組間比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CaM在外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)水平

各組研究對象單個核細(xì)胞中CaM的表達(dá)水平如圖1～2所示。與對照組比較，AD患者外周血中CaM的表達(dá)水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PSP、FTD、PD患者單個核細(xì)胞中CaM的表達(dá)水平略高于對照組，DLB患者略低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　CaM在各組研究對象單個核細(xì)胞中表達(dá)的Western blot結(jié)果

2.2CaM在外周血血漿中的表達(dá)水平

CaM在不同研究對象血漿中的表達(dá)趨勢與單個核細(xì)胞中的表達(dá)相似，AD患者的表達(dá)水平顯著高于對照組 （P＜0.05）；PSP、DLB、FTD和PD患者血漿中的表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2　CaM在各組研究對象單個核細(xì)胞中的相對表達(dá)水平

圖3　CaM在各組研究對象血漿中的表達(dá)水平

2.3CaM在不同嚴(yán)重程度疾病中的表達(dá)水平

CaM在對照組、MCI患者和不同嚴(yán)重程度AD患者中的表達(dá)水平如圖4～5所示。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，MCI患者的表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不同嚴(yán)重程度AD患者的表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但是，輕、中度AD和重度AD之間的CaM表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4　CaM在不同嚴(yán)重程度的疾病中表達(dá)的Western blot結(jié)果

2.4CaM在不同患者中診斷AD的效能比較

ROC曲線繪制結(jié)果顯示，CaM作為生物標(biāo)志物在對照組、PSP、DLB、FTD、PD患者中診斷AD的曲線下面積分別為0.958、0.946、0.846、0.958和0.896，具有較高的診斷價值。根據(jù)SPSS軟件所給出各點敏感性和1-特異性的值找出敏感性+特異性-1最大值的點作為截點，該點的敏感性和特異性即為該曲線敏感性特異性值，具體見表2。

圖5　CaM在不同嚴(yán)重程度疾病中的相對表達(dá)水平

表2　CaM作為生物標(biāo)志物診斷AD的效能比較

3　討論

AD的發(fā)病機制目前并不清楚，目前存在多種假說［8-9］。而不論在鈣離子失衡假說還是淀粉體假說中，CaM均發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［10］?，F(xiàn)已證明，CaM對多種神經(jīng)活動起著重要的調(diào)控作用，其與多種蛋白配合，可調(diào)控突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸的多種電生理活動［11-12］。目前，雖然CaM在AD發(fā)病中發(fā)揮的作用并不完全清楚，但是大量臨床研究和動物實驗均表明AD患者海馬區(qū)及外周血中CaM和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent proteinkinaseⅡ，CaMKⅡ）表達(dá)存在異常，可能是一種潛在的AD生物標(biāo)志物［13-14］。Esteras等［15］報道，AD患者外周血單個核細(xì)胞中的CaMKⅡ較正常細(xì)胞表達(dá)上升，CaMKⅡ是CaM的下游效應(yīng)蛋白，這可能預(yù)示著AD患者外周血細(xì)胞中CaM的異常表達(dá)。本研究通過檢測AD患者外周血單個核細(xì)胞和血漿中CaM的表達(dá)水平，探討其作為AD生物標(biāo)志物的潛在價值。

本研究結(jié)果顯示，AD患者外周血單個核細(xì)胞中CaM的表達(dá)水平顯著高于對照組和PSP、DLB、FTD、PD患者。通過繪制ROC曲線，可見對照組及其他癡呆患者的曲線下面積均大于0.75，表明CaM作為生物標(biāo)志物診斷AD的準(zhǔn)確性較高。筆者又檢測了各研究對象血漿中CaM的表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)呈現(xiàn)出與單個核細(xì)胞類似的變化趨勢，這可能為AD的診斷提供了一種更為便捷的方法。研究表明，CaM和鈣調(diào)蛋白激酶家族在包括G1/S、G2/M等多個細(xì)胞周期檢查點中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用［16］。很多細(xì)胞周期蛋白中存在CaM結(jié)合位點，且有絲分裂可以刺激Ca2+-CaM介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞對Ca2+敏感性和CaM在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布發(fā)生變化，最終導(dǎo)致CaM和CaM結(jié)合位點相互作用異常，Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡［17］。同時，葡萄糖代謝降低、β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生、炎性反應(yīng)等也可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變［18］。細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載則進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，CaM在AD患者的外周血單個核細(xì)胞和血漿中均高表達(dá)，具有較高的診斷價值，是一種潛在的AD生物標(biāo)志物。但是本研究也存在一定的缺陷，如樣本量較小，且納入的其他癡呆性疾病并不全面，這些都需要在以后的工作中進(jìn)一步完善。

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Diagnostic value of calmodulin in peripheral blood for Alzheimer disease

GAO Lili1TANG Yongchun1MAO Dejun1XING Yan2▲

1.Department of Neurology，the Affiliated Hiser Hospital of Qingdao University Medical College，Shandong Province，Qingdao266000，China；2.Department of Neurology，Aviation General Hospital of China Medical University，Beijing 100012，China

Objective To test the expression levels of calmodulin（CaM）in the mononuclear cells and plasma of peripheral blood of patients with Alzheimer disease（AD），and to evaluate its diagnostic value as the biomarker of AD. Methods Total 116 objects treated and examined in the Affiliated Hiser Hospital of Qingdao University Medical College from February 2013 to January 2015 were enrolled into the research，including 40 cases with AD，20 cases with mild cognitive impairment（MCI），20 cases with Parkinson disease（PD），10 cases with frontotemporal dementia （FTD），10 cases with dementia with Lewy bodies（DLB），6 cases with progressive supranuclear palsy（PSP）and 10 healthy cases with normal cognition（control group）.The peripheral blood was obtained to separate the mononuclear cells and plasma.Western blotand enzyme-linked immuno sorbentassay（ELISA）were used to test the levels of CaM in mononuclear cells and plasma of peripheral blood respectively，and receiver operating characteristic（ROC）curve was drawn to estimate the diagnostic value of CaM.Results Compared with the control group，the levels of CaM in the mononuclear cells and plasma of peripheral blood of patients with AD were significantly higher than those of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），and the expression level of CaM did not change with the progress of AD.The expression of CaM in control group and PSP，DLB，F(xiàn)TD，PD patients was as standard to draw ROC curve，the area under the ROC curve was 0.958，0.946，0.846，0.958 and 0.896 respectively.Conclusion CaM is highly expressed in the mononuclear cells and plasma of peripheral blood of patients with AD，which is a potential biomarker of AD.

Alzheimer disease；Calmodulin；Peripheral blood；Biomarker；Diagnostic value

R741

A

1673-7210（2016）01（b）-0050-04

2015-10-09本文編輯：張瑜杰）

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金資助項目（2007-3122）。
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