李勇波　張孝斌　程　帆　饒　婷　余偉民武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢　430060

穩(wěn)定過表達(dá)m icroRNA-96前列腺癌細(xì)胞株的建立及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

李勇波張孝斌程帆饒婷余偉民
武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢430060

目的 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)microRNA-96（miR-96）的前列腺癌DU-145細(xì)胞株并研究其對(duì)DU-145細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法 構(gòu)建miR-96慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞DU-145，嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)miR-96（實(shí)驗(yàn)組）及陰性對(duì)照（對(duì)照組）的細(xì)胞株；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞miR-96的表達(dá)；克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組的細(xì)胞增殖情況。transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果經(jīng)過篩選后各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)光效率均＞90%；qRT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組miR-96表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組克隆形成率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；MTT實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度值均低于對(duì)照組（P＜0.05）；transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論 miR-96可抑制前列腺細(xì)胞的增殖和遷移能力，可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

前列腺癌；m icroRNA-96；增殖；遷移

前列腺癌是一種常見惡性泌尿系統(tǒng)腫瘤，全球范圍內(nèi)每年約有20萬例患者死于前列腺癌［1］。前列腺癌的發(fā)病原因迄今仍不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由內(nèi)源性基因編碼，長度為19～22個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA。目前，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)［2-5］，與惡性腫瘤關(guān)系密切，大約有調(diào)控miRNA編碼基因位的52%位于腫瘤相關(guān)染色體區(qū)域［6］。已有研究證明，miR-96在多種腫瘤中低表達(dá)，如：膀胱癌、乳腺癌、直腸癌等，是潛在的腫瘤抑制因子［7-11］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建過表達(dá)miR-96的慢病毒載體來感染前列腺癌DU-145細(xì)胞株，以構(gòu)建過表達(dá)miR-96的前列腺癌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并分別進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)，研究miR-96對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1　材料與方法

1.1m iR-96慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建與包裝

實(shí)驗(yàn)所需重組穿梭質(zhì)粒LV3和包裝質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司制備。LV3質(zhì)粒攜帶熒光蛋白表達(dá)基因及嘌呤霉素抗性基因。miR-96基因片段的導(dǎo)入及病毒包裝由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成?；蚱涡蛄蟹謩e如下。miR-96：5′-TTGTGCTTGATCTAACCATGT-3′；陰性對(duì)照：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′。經(jīng)基因測(cè)序確定序列導(dǎo)入成功。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

前列腺癌細(xì)胞株：DU-145（購自中科院上海細(xì)胞庫），用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，按常規(guī)方法培養(yǎng)及傳代。胎牛血清（Gib co）、青霉素和鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；1640培養(yǎng)基（Gibco）、0.25%胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；嘌呤霉素粉劑（北京索萊寶科技有限公司）；普通顯微鏡及熒光顯微鏡（日本Olympus）；熒光定量PCR儀（日本Olympus）。

1.3嘌呤霉素篩選濃度的確定

生理鹽水配制終濃度為0.5 g/L的嘌呤霉素溶液，并用0.22μm過濾器過濾；篩選前1 d接種5.5× 104個(gè)細(xì)胞至24孔板中，加入500μL完全培養(yǎng)基，37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%；按梯度濃度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4 mg/L）嘌呤霉素溶液加入24孔板中，每隔1 d換新鮮含嘌呤霉素的溶液（濃度不變），培養(yǎng)3 d，使DU-145細(xì)胞全部死亡的嘌呤霉素最低濃度即為篩選濃度。嘌呤霉素的最佳篩選濃度為1.6mg/L。

1.4慢病毒載體感染前列腺癌細(xì)胞

慢病毒感染細(xì)胞前1 d接種4.0×103個(gè)DU-145細(xì)胞于96孔板中，100μL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5% 的CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%；吸棄舊培養(yǎng)基，加入90μL新鮮培養(yǎng)基，然后加入滴度為1×107TU/mL的病毒液。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；48 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光情況。

1.5穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選及熒光效率檢測(cè)

慢病毒感染細(xì)胞后，待96孔板中的細(xì)胞完全融合，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6孔板中培養(yǎng)，加入濃度為1.6 mg/L的嘌呤霉素的培養(yǎng)基1mL。每24小時(shí)換新鮮含篩選濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下（200×）觀察熒光表達(dá)情況。篩選2周后獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。篩選培養(yǎng)期間根據(jù)細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行傳代。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)m iR-96的表達(dá)

獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的RNA，RNA抽提使用QuantoBio Total RNA Isolation Kit（Tiangen公司）進(jìn)行，利用PrimeScriotTMRT reagent Kit（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，反應(yīng)條件為37℃、15min，85℃、5 s；以第一條鏈cDNA為模板，利用SYBR Green PCR MasterMix（Tiangen公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)在20μL的體系中進(jìn)行，擴(kuò)增條件為預(yù)變性：95℃×15min，1個(gè)循環(huán)；變性：95℃×10 s，40個(gè)循環(huán)；退火/延伸：60℃×32 s，40個(gè)循環(huán)。U6 snRNA作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。miRNA相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt，ΔCt=（CtmiRNA-CtU6）。逆轉(zhuǎn)錄引物為試劑盒內(nèi)通用引物。擴(kuò)增引物：miR-96上游：5′-TCTGGGTACCGCACTGGTAGAATTCACTG-3′；下游：5′-CCTTTCTAGACCACGGCACCATTCAGGA-3′；U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.7克隆形成實(shí)驗(yàn)

獲得實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，消化生長對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整濃度為800個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞分別接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每3天更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)10 d后，吸棄每孔培養(yǎng)液，0.5%結(jié)晶紫染色顯微鏡下（200×）計(jì)數(shù)克隆數(shù)。每大于50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)數(shù)為1個(gè)克隆團(tuán)，克隆形成率=（克隆團(tuán)數(shù)/鋪板細(xì)胞數(shù)）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8MTT實(shí)驗(yàn)

消化生長對(duì)數(shù)期的各組細(xì)胞，調(diào)整濃度分別為1.0×103個(gè)/mL，分別于接種后24、48、72、96 h將每孔加入MTT溶液（濃度0.5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜，37℃恒溫?fù)u床上低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長處測(cè)量各孔OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9transwell遷移實(shí)驗(yàn)

消化生長對(duì)數(shù)期各組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/mL，，每個(gè)小室上室加150μL細(xì)胞懸液，下室加600μL含10%血清的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h。取出小室，甲醇固定后用0.1%結(jié)晶紫染色，切下底膜移至載玻片上，用中性樹膠封片，在顯微鏡下（200×）隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值。1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組熒光顯微鏡下穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的發(fā)光情況

經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)和嘌呤霉素篩選2周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，熒光顯微鏡同一高倍鏡視野下觀察細(xì)胞發(fā)光情況，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組發(fā)光細(xì)胞數(shù)均＞90%。見圖1。

圖1　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組熒光顯微鏡與非熒光顯微鏡下穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的發(fā)光情況（200×）

2.2實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中m iR-96的表達(dá)情況

qRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中miR-96的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)組miR-96的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，倍數(shù)改變?yōu)?5.937±0.129，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P= 0.0002）。見圖2。miR-96在DU-145細(xì)胞中成功穩(wěn)定過表達(dá)。

圖2　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中m iR-96的表達(dá)情況

2.3實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的克隆形成情況

培養(yǎng)10 d后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞固定染色克隆形成情況見圖3，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的克隆形成率分別為（9.67±2.52）%、（30.52±4.51）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0034），見圖4。miR-96可以明顯抑制DU-145的克隆形成。

圖3　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的克隆形成情況（結(jié)晶紫染色法,200×）

圖4　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組克隆形成率比較

2.4實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞于接種后連續(xù)4 d測(cè)吸光度值，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值分別為 0.1677±0.0047、0.2047±0.0090、0.2631±0.0083、0.3480±0.0054，對(duì)照組吸光度值分別為0.1683±0.0069、0.2790±0.0034、0.4285± 0.0031、0.4971±0.0046，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。miR-96在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可抑制DU-145細(xì)胞的增殖。2.5實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的穿膜細(xì)胞情況

圖5　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況

培養(yǎng)8 h后，固定染色，高倍顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的穿膜細(xì)胞情況見圖6。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（85.00±11.52）、（190.70±13.57）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0052），說明miR-96可抑制DU-145細(xì)胞的遷移能力。

圖6　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的穿膜細(xì)胞情況（結(jié)晶紫染色法,200×）

3　討論

近年來，大量癌性相關(guān)miRNA分子與多種信號(hào)通路或轉(zhuǎn)錄因子存在交互作用共同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。隨著對(duì)miRNA調(diào)控及腫瘤相關(guān)信號(hào)通路研究的深入，以干擾oncomiRs表達(dá)為基礎(chǔ)的策略將為腫瘤的治療提供廣闊的前景。miRNA可通過與靶基因mRNA的特異性堿基配對(duì)，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)［12］，能降調(diào)節(jié)其相應(yīng)的蛋白編碼的靶基因。到目前為止，已有706個(gè)人類miRNA被鑒定。miRNA與多種腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系，在多種癌細(xì)胞中有miRNA的異常表達(dá)或突變。miRNA既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性，又可作為癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性。生物信息和實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)顯示，成千上萬的蛋白編碼的基因共同由miRNA調(diào)節(jié)。研究已表明，miRNA在人類的許多生物過程中發(fā)揮著重要作用，如代謝、分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡［13-14］。一些miRNA在腫瘤組織中表達(dá)異常，參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。多數(shù)在腫瘤中高表達(dá)的miRNA起著癌基因的作用，而低表達(dá)或表達(dá)缺失的miRNA在腫瘤中起抑癌基因的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，失調(diào)的miRNA與腫瘤的起源和進(jìn)展相關(guān)，表明miRNA在癌癥診斷和預(yù)后中可以作為一種生物標(biāo)志物［15-16］。盡管對(duì)miRNA功能的理解有很大的進(jìn)展，但miRNA在前列腺癌中的作用尚不清楚。

病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，其優(yōu)點(diǎn)在于它能夠感染多種難感染的細(xì)胞，比如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等，而且慢病毒能夠?qū)⑼庠椿虿迦爰?xì)胞基因組內(nèi)，實(shí)現(xiàn)長時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因。慢病毒介導(dǎo)的miRNA過表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立，使實(shí)驗(yàn)研究一勞永逸。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建過表達(dá)miR-96的慢病毒載體感染前列腺癌細(xì)胞株DU-145，從而獲得穩(wěn)定過表達(dá)miR-96的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的慢病毒載體的穿梭質(zhì)粒帶有嘌呤霉素的抗性基因和綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)基因及miR-96或陰性對(duì)照基因片段。當(dāng)慢病毒感染細(xì)胞后，miR-96或陰性對(duì)照基因及嘌呤霉素的抗性基因和GFP基因可整合進(jìn)入宿主基因組并穩(wěn)定表達(dá)。這樣宿主細(xì)胞在實(shí)現(xiàn)過表達(dá)miR-96或陰性對(duì)照的同時(shí)也具有嘌呤霉素抗性和表達(dá)GFP。通過嘌呤霉素分別作用于DU-145細(xì)胞，得到其最佳的篩選濃度。進(jìn)行嘌呤霉素壓力篩選時(shí)未感染的細(xì)胞或嘌呤霉素基因表達(dá)缺失的細(xì)胞將會(huì)被殺死，用篩選濃度連續(xù)培養(yǎng)2周，同一高倍鏡視野下觀察細(xì)胞發(fā)光情況，發(fā)光細(xì)胞數(shù)均＞90%。最后分別提取了三株細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組RNA，通過qRT-PCR來檢測(cè)其miR-96的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組miR-96的表達(dá)要明顯高于對(duì)照組，說明miR-96在細(xì)胞中成功穩(wěn)定過表達(dá)。

生長快、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲性是腫瘤細(xì)胞的特性，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致晚期前列腺癌患者死亡的主要原因［17］。因此早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，并抑制其生長和轉(zhuǎn)移是治療腫瘤的關(guān)鍵。近年隨著miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)大量異常表達(dá)的miRNA通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此大規(guī)模地篩選腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中異常表達(dá)的miRNA，將為人們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)腫瘤的生物學(xué)特性發(fā)揮重要作用［18］，也為前列腺癌的早期診治提供了新的希望。miRNA發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控的機(jī)制為：成熟的miRNA與調(diào)節(jié)蛋白Argonaute2（Ago2）結(jié)合，進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過降解靶mRNA、抑制靶mRNA翻譯或使靶mRNA脫腺苷化而發(fā)揮作用［19］。多數(shù)miRNA具有高度時(shí)序性、保守性和細(xì)胞組織特異性，同時(shí)受到發(fā)育和空間調(diào)控，從而參與細(xì)胞的增殖、分化和死亡過程［20-21］。有研究認(rèn)為，miRNA可作為癌基因或抑癌基因而發(fā)揮作用，miRNA可能成為診斷腫瘤的新的分子標(biāo)志和判斷腫瘤治療及預(yù)后的分子靶點(diǎn)［22］，miR-96通過調(diào)控不同靶基因影響多種腫瘤細(xì)胞的生物功能。Kriebel等［23］、Siu等［24］研究發(fā)現(xiàn)，泌尿上皮腫瘤患者血清中miR-96的水平異常，推測(cè)miR-96可能成為泌尿上皮腫瘤診斷和預(yù)后分析的腫瘤標(biāo)志物。本研究通過transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-96可抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移能力，通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)表明，miR-96可抑制前列腺癌細(xì)胞DU-145的增殖，初步實(shí)驗(yàn)表明，miR-96可調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的生物過程，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)miR-96的前列腺癌細(xì)胞株，為以后分析miR-96對(duì)前列腺癌生物學(xué)功能影響的研究奠定了基礎(chǔ)。增殖實(shí)驗(yàn)表明，miR-96可抑制前列腺癌細(xì)胞DU-145的增殖，為診斷和治療前列腺癌提供了新的方向。

［1］Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［2］Hayes J，Peruzzi PP，Lawler S.Micro RN Asin cancer：biomarkers，functions and therapy［J］.Trends Mol Med，2014，20（8）：460-469.

［3］Megiorni F，Cialfi S，Mcdowell HP，et al.Deep Sequencing themicroRNA profile in rhabdomyosarcoma reveals down-regulation of miR-378 familymembers［J］.BMC Cancer，2014，14（1）：880.

［4］Hartman LL，Crawford JR，MakaleMT，etal.Pediatric phase Ⅱtrials of poly-ICLC in the management of newly diagnosed and recurrent brain tumors［J］.JPediatr Hematol Oncol，2014，36（6）：451-457.

［5］Mathew LK，SkuliN，MucajV，etal.miR-218 opposes a critical RTK-HIF pathway in mesenchymal glioblastoma［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（1）：291-296.

［6］Esquela-Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-micro RNAs with a role in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2006，6（4）：259-269.

［7］Schaefer A，Jung M，Mollenkopf HJ，et al.Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma［J］.Int JCancer，2010，126（5）：1166-1176.

［8］Schaefer A，JungM，Miller K，etal.Suitable reference genes for relative quantification of miRNA expression in prostate cancer［J］.Exp Mol Med，2010，42（11）：749-758.

［9］LeiSL，Zhao H，Yao HL，etal.Regulatory roles of microRNA-708 and microRNA-31 in proliferation，apoptosis and invasion of colorectal cancer cells［J］.Oncol Lett，2014，8 （4）：1768-1774.

［10］Bo Y，Guo G，Yao W.MiRNA-mediated tumor specific delivery of TRAIL reduced glioma growth［J］.JNeurooncol，2013，112（1）：27-37.

［11］Cooper LA，Gutman DA，Chisolm C，et al.The tumor microenvironment strongly impacts master transcriptional regulators and gene expression class of glioblastoma［J］. Am JPathol，2012，180（5）：2108-2119.

［12］Filipowicz W，Bha ttacharyya SN，Sonenberg N.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs：are the answers in sight？［J］.Nat Rev Genet，2008，9（2）：102-114.

［13］Wu C，Bardes EE，Jegga AG，et al.ToppMiR：ranking microRNAs and the irmRNA targets based on biological functions and context［J］.Nucleic Acids Res，2014，42（Web Server issue）：W107-W113.

［14］Huang Y，Shen XJ，Zou Q，et al.Biological functions of microRNAs：a review［J］.JPhysiol Biochem，2011，67（1）：129-139.

［15］Dimitriadis E，Kalogeropoulos T，Velaeti S，et al.Study of genetic and epigenetic alterations in urine samples as diagnostic markers for prostate cancer［J］.Anticancer Res，2013，33（1）：191-197.

［16］Deng D，Liu Z，Du Y.Epigenetic alterations as cancer diagnostic，prognostic，and predictive biomarkers［J］.Adv Genet，2010，71：125-176.

［17］Gernone A，Bordonaro S，Tralongo P.Optimal sequence of bone target drugs in metastatic prostatic cancer［J］. Expert Rev Anticancer Ther，2015，15（8）：923-929.

［18］Nicolaidou V，Koufaris C.MicroRNA responses to environmental liver carcinogens：biological and clinical significance［J］.Clin Chim Acta，2015，445：25-33.

［19］Kiriakidou M，Tan GS，LamprinakiS，etal.AnmRNAm7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation［J］.Cell，2007，129（6）：1141-1151.

［20］Zeng Y.Principles ofmicro-RNA production and maturation［J］.Oncogene，2006，25（46）：6156-6162.

［21］Shomron N，Levy C.MicroRNA-biogenesis and pre-mRNA splicing crosstalk［J］.JBiomed Biotechnol，2009，2009：594678.

［22］Jemal A，SiegelR，Ward E，etal.Cancer statistics，2008［J］. CA Cancer JClin，2008，58（2）：71-96.

［23］Kriebel S，Schmidt D，Holdenrieder S，et al.Analysis of tissue and serum microRNA expression in patients with upper urinary tract urothelial cancer［J］.PLoSOne，2015，10（1）：e117284.

［24］Siu MK，Tsai YC，Chang YS，et al.Transforming growth factor-beta promotes prostate bone metastasis through induction of microRNA-96 and activation of the mTOR pathway［J］.Oncogene，2015，（34）：4767-4776.

Establishing of microRNA-96 stable overexpression cell lines of prostatic cancer and its effect on proliferation and migration of prostatic cancer cells

LIYongbo ZHANG XiaobinCHENG FanRAO Ting YUWeimin
Department of Urology，People′s Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan 430060，China

Objective To establish microRNA-96（miR-96）stable overexpression cell lines of cervical cancer and detect its effect on proliferation of prostatic cancer cell lines DU-145.Methods Lentiviral vector stable overexpressing miR-96 was constructed and prostatic cancer cell lines DU-145 were transfected（experimental group）.The transfection cells were screened by using of puromycin and the stable transfection cell lines were obtained（control group）.Endogenous miR-96 levels in two groups were measured by quantitative RT-PCR（qRT-PCR）.The proliferation of DU-145 cells in two groups were detected by clonogenic proliferation assay and MTT assay.The migration of DU-145 cells in two groups were assessed by trans well assay.Results After screening，luminous efficiency rate of trans fection cell in each group was over 90%.qRT-PCR showed that the expression level of miR-96 in experimental group was significantly higher than that in control group（P＜0.05）.Colony formation assay showed that the clonogenicity rate of experimental group was significantly lower than that of control group（P＜0.05）.MTT assay demonstrated that absorbance values all time points of experimental group were lower than those of control group（P＜0.05）.Trans well assay revealed that the number of cells through the well in experimental group were less than that in control group（P＜0.05）.Conclusion miR-96 can inhibit proliferation and migration of prostatic cancer cells and may be involved in the development of prostatic cancer.

Prostatic cancer；MicroRNA-96；Proliferation；Migration

R737.25

A

1673-7210（2016）01（b）-0024-05

2015-06-15本文編輯：李亞聰）

李勇波（1988.5-），男，武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科專業(yè)2013級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：泌尿系腫瘤。

張孝斌（1944.9-），男，教授，主任醫(yī)師；研究方向：泌尿系腫瘤及結(jié)石。