朱鴻武　謝子英　李炳玲　雷昌賢　周梅花　孫大勇　趙亞剛▲.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州　5000；.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣東廣州　5000

芹菜素對食管鱗狀細(xì)胞癌TE-1細(xì)胞順鉑敏感性的影響及機制

朱鴻武1謝子英1李炳玲2雷昌賢1周梅花1孫大勇1趙亞剛1▲
1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510010；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510010

目的探討芹菜素對食管鱗狀細(xì)胞癌TE-1細(xì)胞順鉑敏感性的影響及機制。方法通過CCK-8實驗檢測芹菜素對TE-1細(xì)胞的抑制作用，再通過CCK-8實驗和平板克隆實驗檢測TE-1細(xì)胞在芹菜素作用下對順鉑敏感性的改變，最后通過Western blot和Hoechst 33258核染色等實驗檢測芹菜素導(dǎo)致TE-1細(xì)胞對順鉑敏感性發(fā)生變化的具體機制。結(jié)果 芹菜素顯著地抑制了食管鱗狀細(xì)胞癌TE-1細(xì)胞的生長，且這一作用具有濃度依賴性；CCK-8實驗和平板克隆實驗結(jié)果顯示聯(lián)合芹菜素可增強TE-1細(xì)胞對順鉑的敏感性，且這一作用具有濃度依賴性；芹菜素可以增加TE-1細(xì)胞在順鉑作用下的凋亡，減少內(nèi)源性GRP78蛋白的表達。結(jié)論芹菜素可以增加TE-1細(xì)胞對順鉑的敏感性，可能成為一種新的食管鱗狀細(xì)胞癌化療輔助用藥。

芹菜素；食管鱗狀細(xì)胞癌；順鉑；敏感性

食管癌是世界排名第6位的致死性腫瘤［1］，在我國則表現(xiàn)為第4位致死性的腫瘤，在高發(fā)的省份如河南、河北和四川，其致死性居腫瘤第1位［2］。食管癌主要包括食管鱗狀細(xì)胞癌（以下簡稱“食管鱗癌”）和食管腺癌兩大類型，在我國食管癌病例中90%為食管鱗癌［3］。相當(dāng)多的食管癌患者在確診時已經(jīng)無法單純通過外科手術(shù)根治，即使術(shù)前予以新輔助化療，聯(lián)合手術(shù)治療的預(yù)后仍不佳，5年存活率僅為20%［4］。因此，如何提高食管癌放化療有效性成為近年來食管癌的研究熱點之一。順鉑是食管鱗癌化療方案中的一種重要化療藥物，其抗腫瘤作用在多年臨床應(yīng)用中已得到了較好的驗證，但常規(guī)順鉑化療劑量亦常常會導(dǎo)致消化道不良反應(yīng)、過敏反應(yīng)、腎毒性、骨髓抑制、神經(jīng)毒性、耳毒性，使得順鉑的臨床應(yīng)用受到了一定的影響。如何降低順鉑的不良反應(yīng)，同時保留其殺傷腫瘤的有效性，成為臨床醫(yī)務(wù)工作者和科研人員所關(guān)注的重要問題。

芹菜素（Apigenin）是一種廣泛存在于水果和蔬菜當(dāng)中的植物黃酮，食用安全性較好。近年來已有多項研究報道，芹菜素具有抗感染、抗氧化和抗腫瘤等生物學(xué)活性［5］。并且，芹菜素已被報道對多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、前列腺癌和血液系統(tǒng)等腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用或引起腫瘤細(xì)胞的凋亡［5-11］。但是芹菜素對食管鱗癌順鉑敏感性影響的研究國內(nèi)外鮮有報道。如果芹菜素可以增強食管鱗癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，則有可能在臨床中作為一種有效的輔助用藥可以減少順鉑的用量，進而減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，本研究使用芹菜素聯(lián)合順鉑對食管鱗癌TE-1細(xì)胞進行干預(yù)，采用體外藥敏實驗和細(xì)胞凋亡等實驗觀察聯(lián)合芹菜素干預(yù)前后食管鱗癌TE-1細(xì)胞對順鉑的敏感性改變，初步闡明芹菜素在食管鱗癌細(xì)胞對順鉑藥物敏感性中的作用和機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、5X蛋白上樣緩沖液、麗春紅染色液、CCK-8試劑盒和結(jié)晶紫（自碧云天生物技術(shù)研究所）；RPMI1640培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清（Hyclone公司）；NC膜和ECL（Millipore）；Hoechst染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；anti-β-actin一抗（sc-47778）和anti-GRP78一抗（sc-166490）（Santa Cruz Biotechnology）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；cisplatin和pigenin（SIGMA-ALDRICH公司）；人食管鱗癌TE-1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)TE-1細(xì)胞使用添加有10%胎牛血清和加入青霉素/鏈霉素的RPMI 1640。細(xì)胞置于含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。用于實驗的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2CCK-8生長曲線和藥敏實驗使用胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸，以5×103個/孔（生長曲線實驗中為1×103個/孔）接種于96孔板，每孔加培養(yǎng)液200μL，細(xì)胞貼壁16 h后加入適當(dāng)濃度藥物進行體外藥物敏感性檢測，同時設(shè)置調(diào)零孔和對照孔，繼續(xù)孵育72 h（生長曲線實驗培養(yǎng)1～7 d）；72 h以后（生長曲線實驗則每天取出）取出96孔板，每孔加入CCK-8 20μL，孵育4 h；酶標(biāo)儀檢測吸光度并分析。①設(shè)置5、10、20μmol/L芹菜素干預(yù)組，僅加入同等濃度溶媒DMSO的細(xì)胞組作為對照組，觀察不同濃度芹菜素對TE-1細(xì)胞的生長抑制作用。②設(shè)置加入0.000、0.008、0.040、0.200μg/mL順鉑的4個TE-1細(xì)胞組，每組細(xì)胞還分為加入0、5、10、20μmol/L的芹菜素，觀察不同濃度芹菜素聯(lián)合順鉑對TE-1細(xì)胞的殺傷作用。

1.2.3克隆形成實驗使用胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸，以1×103個/孔的密度接種于24孔板，細(xì)胞貼壁16 h后加入適當(dāng)濃度的藥物進行體外藥物敏感性檢測，每隔3 d更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)14 d；之后，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次；甲醇固定10 min，棄固定液，加入含0.5%結(jié)晶紫甲醇染色10 min，PBS洗3次；晾干培養(yǎng)板，用數(shù)碼相機拍照，使用Photoshop CS3軟件進行圖像分析。設(shè)置1個加入0μg/mL順鉑TE-1細(xì)胞組和3個加入0.04μg/mL順鉑的TE-1細(xì)胞組，后3個組分別加入0、5、10μmol/L的芹菜素，通過克隆形成實驗觀察芹菜素聯(lián)合順鉑對TE-1細(xì)胞克隆形成的影響。

1.2.4Hoechs t核染色凋亡檢測 使用胰酶消化細(xì)胞，按1×106個/孔的密度接種于6孔板，細(xì)胞貼壁16 h后加入適當(dāng)濃度藥物，置于培養(yǎng)箱中孵育36 h誘導(dǎo)凋亡，棄培養(yǎng)液，固定液固定20min，棄固定液，PBS洗2次，加0.5mL Hoechst 33258染色液，避光染色5min，棄染色液，PBS避光洗2次，抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。凋亡的判斷方法：正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。凋亡率的計算方法：隨機選擇200倍鏡下5個視野計算凋亡率，并取平均值。設(shè)置1個加入0μg/mL順鉑TE-1細(xì)胞組和3個加入0.2μg/mL順鉑的TE-1細(xì)胞組，后3個組分別加入0、5、10μmol/L的芹菜素，通過Hoechst 33258核染色實驗觀察芹菜素對TE-1細(xì)胞在順鉑作用下凋亡的影響。

1.2.5Wes t ern b l ot 使用胰酶消化細(xì)胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，加入5X蛋白上樣緩沖液加熱5min，SDS-PAGE蛋白電泳，將分離的蛋白濕轉(zhuǎn)至NC膜，麗春紅染色，裁剪，PBST洗膜3次，以5%脫脂牛奶PBST封閉1 h，封閉液稀釋適當(dāng)濃度的一抗后與條帶在4℃過夜，PBST洗膜3次，用封閉液稀釋適當(dāng)濃度的二抗與條帶室溫下孵育1 h；PBST洗膜4次，加ECL溶液，暗室顯影觀察。設(shè)置3個加入0.2μg/mL順鉑的TE-1細(xì)胞組，分別加入0、5、10μmol/L的芹菜素，通過Western blot實驗檢測芹菜素對順鉑作用下TE-1細(xì)胞中GRP78蛋白表達的影響。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1芹菜素對TE-1細(xì)胞的抑制作用

CCK-8實驗結(jié)果提示，芹菜素對TE-1細(xì)胞具有生長抑制的作用，且有明顯的濃度依賴性。見表1。

2.2不同濃度芹菜素聯(lián)合順鉑對TE-1細(xì)胞的殺傷作用

使用不同濃度芹菜素聯(lián)合低濃度順鉑共同作用于TE-1細(xì)胞以后，CCK-8藥敏實驗結(jié)果提示，與單用順鉑比較，芹菜素可以顯著增加食管鱗癌TE-1細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性（P＜0.05），且這一作用隨芹菜素濃度增加而增強，有濃度依賴性。見表2。

表1　芹菜素對TE-1細(xì)胞的生長抑制作用（OD值）

表2　TE-1細(xì)胞在不同濃度芹菜素聯(lián)合較低濃度順鉑作用下的細(xì)胞存活率（%）

2.3芹菜素聯(lián)合順鉑可顯著減少TE-1細(xì)胞的克隆形成

不同濃度芹菜素和順鉑作用于TE-1細(xì)胞后，平板克隆實驗結(jié)果提示，與僅加入順鉑組克隆形成率（82.83%）比較，加入5μmol/L的芹菜素以后，TE-1細(xì)胞克隆形成率明顯減少（44.30%）；進一步提高芹菜素濃度（10μmol/L）后，TE-1細(xì)胞克隆形成率出現(xiàn)進一步下降（29.77%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示芹菜素可以增強順鉑對TE-1細(xì)胞的殺傷作用。

2.4芹菜素可明顯增加TE-1細(xì)胞在順鉑作用下的凋亡

Hoechst 33258核染色結(jié)果顯示，與不加藥對照組和僅加順鉑組相比，在芹菜素聯(lián)合順鉑作用于TE-1細(xì)胞后核濃染和碎裂的細(xì)胞顯著增多（圖1），且當(dāng)加入的芹菜素濃度逐步增加后，發(fā)生凋亡和壞死的細(xì)胞數(shù)目均進一步增多，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖2），提示芹菜素促進了順鉑誘發(fā)的TE-1細(xì)胞凋亡。

2.5芹菜素可在聯(lián)合順鉑作用下使TE-1細(xì)胞GRP78的表達減少

Western blot檢測結(jié)果提示，與單用順鉑組比較，TE-1細(xì)胞在聯(lián)合芹菜素作用后GRP78蛋白的表達顯著減少，且這一作用隨芹菜素濃度升高更加明顯。見圖3。

圖1　倒置熒光顯微鏡下順鉑聯(lián)合芹菜素引起TE-1細(xì)胞凋亡的Hoechst 33258核染色結(jié)果（200×）

圖2　各組凋亡率的比較結(jié)果

圖3　芹菜素使順鉑作用下TE-1細(xì)胞的GRP78蛋白的表達

3　討論

近年來，芹菜素作為天然存在于水果和蔬菜的一種植物黃酮，因其具有較強的抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性，受到了越來越多的關(guān)注。在抗腫瘤方面，目前研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過多種途徑抑制腫瘤的生長和促進凋亡的發(fā)生［5］，提示其在抗腫瘤的臨床治療中具有較好的應(yīng)用前景。芹菜素曾被報道可以通過G2/M細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡而對食管鱗癌KYSE-510細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，具體機制與上調(diào)p21和PIG3及下調(diào)cyclin B1有關(guān)［12］。但是，芹菜素對食管鱗癌細(xì)胞化療藥物敏感性和應(yīng)激抵抗的影響尚不清楚，芹菜素與順鉑聯(lián)合在食管鱗癌治療方面的研究也鮮有報道。

在本研究中，首先檢測了芹菜素對TE-1細(xì)胞的抑制作用，初步確定了芹菜素單獨作用抑制細(xì)胞生長的能力；然后，在順鉑聯(lián)合不同濃度的芹菜素干預(yù)下，發(fā)現(xiàn)芹菜素有助于提高順鉑對TE-1細(xì)胞的殺傷性，且這一作用隨芹菜素濃度增加而增強；進一步的凋亡檢測結(jié)果提示，聯(lián)合芹菜素可以增加順鉑導(dǎo)致的TE-1細(xì)胞凋亡；最后，在Western blot檢測中還發(fā)現(xiàn)，芹菜素聯(lián)合順鉑作用于TE-1細(xì)胞后GRP78的表達明顯減少，提示抵抗應(yīng)激能力的減弱可能也是芹菜素聯(lián)合順鉑對TE-1細(xì)胞殺傷作用增強的機制之一。

GRP78是非折疊蛋白反應(yīng)中一種重要的應(yīng)激保護蛋白，也是膜蛋白和分泌蛋白正確折疊和組裝的一種重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶［13-15］。諸如缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和毒性物質(zhì)導(dǎo)致的多種應(yīng)激均可引起GRP78的表達增加，多個研究發(fā)現(xiàn)過表達的GRP78存在于多種惡性腫瘤中，并可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對應(yīng)激抵抗能力和化療藥物耐藥性的增強以及促進侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生［13，16-20］。在本研究中發(fā)現(xiàn)小劑量芹菜素在聯(lián)合較低濃度順鉑的作用下可以明顯增強其抗腫瘤作用，并且這一作用與促進凋亡和引起應(yīng)激保護蛋白GRP78的表達減少有關(guān)，提示芹菜素很可能通過影響食管鱗癌細(xì)胞抗凋亡和對應(yīng)激抵抗的能力，進而導(dǎo)致其對順鉑敏感性發(fā)生改變。然而，引起這些作用的具體信號途徑還有待進一步研究進行闡明。

綜上所述，芹菜素可以有效增強食管鱗癌TE-1細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性，其機制與促進化療藥物作用下的凋亡和降低腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激抵抗能力有關(guān)。因此，聯(lián)合芹菜素有可能降低順鉑在食管鱗癌化療中的用量，從而兼具良好的腫瘤殺傷效應(yīng)和減少其藥物不良反應(yīng)。本研究結(jié)果進一步闡明了芹菜素在抗腫瘤治療中的作用和機制，為今后臨床中食管鱗癌化療用藥方案的優(yōu)化提供了新的理論依據(jù)。

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Effects of Apigenin on Cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma TE-1 cells and its mechanism s

ZHU Hongwu1XIE Ziying1LIBingling2LEIChangxian1ZHOU Meihua1SUN Dayong1ZHAO Yagang1▲
1.Department of Gastroenterology，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangdong Province，Guangzhou510010，China；2.Department of Pharmacy，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangdong Province，Guangzhou510010，China

Objective To investigate the effects of Apigenin on Cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma TE-1 cells and its mechanisms.Methods Firstly，inhibition effect of Apigenin on TE-1 cells was tested using CCK-8 assay.Secondly，while combined with Apigenin，Cisplatin sensitivity change of TE-1 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay.Finally，Western blot and Hoechst 33258 nuclear staining assays were used to investigate the mechanisms of Apigenin-induced Cisplatin sensitivity changes of TE-1 cells.Results Firstly，it demonstrated that Apigenin induced cytotoxic effect on esophageal squamous cell carcinoma TE-1 cells in a dose-dependentmanner.Secondly，CCK-8 assay and colony formation assay also indicated that the Cisplatin sensitivity of TE-1 cells was increased by Apigenin in a dose-dependentmanner.In addition，treatment of TE-1 cells with Apigenin displayed significant Cisplatin-induced apoptosis and reducted of endogenous GRP78 expression.Conclusion Apigenin can increase Cisplatin sensitivity of TE-1 cells and it is a promising adjuvant drug in the chemotherapy in esophageal squamous cell carcinoma.

Apigenin；Esophageal squamous cell carcinoma；Cisplatin；Sensitivity

R285.5

A

1673-7210（2016）01（b）-0012-04

2015-08-10本文編輯：蘇暢）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81302164）；廣東省科技計劃項目（2013B021800049）；廣東省自然科學(xué)基金面上項目（2014A030313595）。

朱鴻武（1978-），男，博士；研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性表型的分子機制。