劉小柳　鄒立新　雷　堅　張曙輝　吳劍雄.湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院血液腫瘤科，湖南長沙　40006；.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，湖南長沙　40006

中高危MDS與MDS/MPN患者骨髓單個核細(xì)胞凋亡及臨床特征比較

劉小柳1鄒立新1雷堅2張曙輝1吳劍雄1
1.湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院血液腫瘤科，湖南長沙410006；
2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，湖南長沙410006

目的 比較中高危骨髓增生異常綜合征（MDS）與骨髓增生異常/骨髓增殖性腫瘤（MDS/MPN）骨髓單個核細(xì)胞（BMNCs）凋亡情況及其與患者臨床特征的關(guān)系。方法 收集2013年7月～2015年7月在湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院血液科就診的8例中高危MDS及5例MDS/MPN患者的骨髓標(biāo)本及臨床資料，AO/EB熒光雙重染色及Caspase-3活性檢測BMNCs凋亡，相關(guān)性分析細(xì)胞凋亡與患者臨床特征的關(guān)系。結(jié)果 凋亡在中高危MDS和MDS/MPN患者BMNCs中的發(fā)生率分別為（10.25±1.77）%、（6.90±1.66）%，前者高于后者（P=0.032）；Caspase-3檢測顯示，中高危MDS患者BMNCs中Caspase-3活性為（0.18±0.04）%，顯著高于MDS/MPN組［（0.07±0.02）%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.028）；相關(guān)性分析顯示，中高危MDS患者BMNCs凋亡率與骨髓原始細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)（r=-0.81，P=0.015），而MDS/MPN凋亡率與骨髓原始細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.90，P=0.037）。結(jié)論BMNCs凋亡率、Caspase-3活性在中高危MDS和MDS/MPN中明顯不同，且BMNCs凋亡和骨髓原始細(xì)胞比例相關(guān)。

骨髓增生異常綜合征；骨髓增生異常/骨髓增殖性腫瘤；細(xì)胞凋亡

最新WHO將慢性髓系惡性腫瘤分為三大類：骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）、骨髓增生異常/骨髓增殖性腫瘤（MDS/MPN）。MDS是一組起源于造血干細(xì)胞的異質(zhì)性惡性克隆性疾?。?］，主要特征是骨髓無效造血和具有高危向急性髓系白血病演變的風(fēng)險［2］。而MDS/MPN是一組臨床表現(xiàn)、實驗室檢查與MDS和MPN重疊的髓系惡性腫瘤，包括慢性粒單核細(xì)胞白血?。–MML）、非典型慢性髓系白血?。╝CML，BCR-ABL陰性）、青少年粒單核細(xì)胞白血?。↗MML）及MDS/MPN無法分類型（MDS/MPN-U）四種類型［3］。

盡管MDS作為一種血液系統(tǒng)疾病已被醫(yī)學(xué)界認(rèn)可多年，但其發(fā)生的病理機制及疾病進(jìn)展的分子基礎(chǔ)仍不清楚，其中，細(xì)胞凋亡失調(diào)在MDS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用［4］。而MDS/MPN作為一種兼有病態(tài)造血和細(xì)胞增殖性質(zhì)的髓系腫瘤，其病理機制目前更是知之甚少［5］，細(xì)胞凋亡在MDS/MPN患者中的作用鮮有報道。作為兩種異質(zhì)性疾病，患者骨髓細(xì)胞凋亡情況如何，尚需進(jìn)一步研究確定。

為比較中高危MDS及MDS/MPN患者中的細(xì)胞凋亡發(fā)生情況，本研究以中高危MDS患者及MDS/ MPN患者的骨髓單個核細(xì)胞（BMNCs）為研究材料，分別采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)凋亡細(xì)胞觀察、Caspase-3活性檢測方法比較兩組患者細(xì)胞凋亡情況；同時觀察了患者的臨床及實驗室檢查特征，對其細(xì)胞凋亡和臨床表型的關(guān)系進(jìn)行了研究。

1　資料與方法

1.1一般資料

本研究收集2013年7月～2015年7月在湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院血液科就診的8例中高危MDS 及5例MDS/MPN患者資料，所有病例均為初治，獲得患者知情同意?；颊吲R床特點見表1。8例MDS患者，依據(jù)患者臨床特征、外周血象、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓組織病理學(xué)、細(xì)胞及分子遺傳學(xué)分析，診斷依據(jù)2006年維也納診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，分型依據(jù)2008WHO標(biāo)準(zhǔn)［7］，危險度分組按照最新修訂的IPSS-R標(biāo)準(zhǔn)［8］。其中，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-1型（RAEB-1）3例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-2型（RAEB-2）5例；中危組2例，高危組3例，極高危組3例。5例MDS/MPN患者，診斷分型依據(jù)2008WHO標(biāo)準(zhǔn)［3］，其中，CMML 2例，MDS/ MPN-U 3例。

1.2方法

采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法對肝素抗凝骨髓標(biāo)本進(jìn)行分離，分離出的骨髓單個核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后分別用于細(xì)胞凋亡檢測及Caspase-3凋亡蛋白酶活性檢測。

1.2.1吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）熒光染料雙重染色法檢測細(xì)胞凋亡在熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，結(jié)構(gòu)正常；早期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，但核呈固縮或串珠狀；晚期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)著橘紅色，呈固縮狀或斑塊狀；壞死細(xì)胞為核染色質(zhì)呈紅色，核結(jié)構(gòu)正常［9］。鏡下每個樣本計數(shù)200個細(xì)胞，計算凋亡百分率。凋亡百分率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/200）×100%。

1.2.2Caspase-3活性檢測 根據(jù)R&D公司提供的Caspase-3活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行。收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解10～20min，4℃12 000 r/min離心1 min，取5μL上清用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，即采用分光光度計測定OD595光密度值。另外45μL加50μL 2×反應(yīng)緩沖液及5μL Caspase-3反應(yīng)底物，于96孔板中 37℃避光孵育1～2 h，采用酶標(biāo)儀測定OD405光密度值。按下述公式計算：Caspase-3相對活性=OD405/OD595。

表1　MDS和MDS/MPN患者的臨床特征

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；若方差不齊，則用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；數(shù)值變量的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。選擇雙向檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1中高危MDS與MDS/MPN患者BMNCs凋亡水平比較

中高危MDS組BMNCs凋亡率為（10.25±1.77）%，MDS/MPN組為（6.90±1.66）%，中高危MDS組BMNCs凋亡率高于MDS/MPN組（P=0.032）。見圖1。 2.2中高危MDS與MDS/MPN患者BMNCs中Caspase-3活性比較

圖1　MDS和MDS/MPN患者BMNCs凋亡率比較

MDS組BMNCs中Caspase-3相對活性為（0.18± 0.04）%，MDS/MPN組Caspase-3相對活性為（0.07± 0.02）%，MDS組BMNCs中Caspase-3相對活性高于MDS/MPN組（P=0.028）。見圖2。

圖2　MDS和MDS/MPN患者Caspase-3活性比較

2.3細(xì)胞凋亡與患者臨床特征的相關(guān)性分析

中高危MDS患者BMNCs凋亡率與骨髓原始細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān) （r=-0.81，P=0.015）（圖3A），而MDS/MPN患者BMNCs凋亡率與骨髓原始細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.90，P=0.037）（圖3B）。但未發(fā)現(xiàn)患者骨髓細(xì)胞凋亡與其染色體核型異常、外周血細(xì)胞減少程度指標(biāo)相關(guān)。

圖3　BMNCs凋亡與骨髓原始細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

3　討論

染色體異常為MDS重要特點之一［10］，本研究MDS病例中也發(fā)現(xiàn)-7、+8、5q-核型異常；并且在MDS/MPN患者中也發(fā)現(xiàn)-7、+8、+9核型異常，但具體哪些基因發(fā)揮關(guān)鍵作用尚不明確，這些基因異常是疾病的始因還是伴隨表現(xiàn)也尚不清楚。盡管MDS和MDS/MPN被認(rèn)為是獨立疾病，但患者表現(xiàn)出重疊的染色體異常［11］，提示兩種疾病可能存在一部分共有的發(fā)病機制。

作為一種具有增殖性質(zhì)的血液系統(tǒng)疾病，雖有研究發(fā)現(xiàn)在MDS/MPN中有部分CMML和MDS/MPN-U患者存在JAK2突變［3］，但與MPN不同的是，大多數(shù)MDS/MPN的增殖與RAS/MAPK信號通路相關(guān)。本研究收集的5例MDS/MPN中，發(fā)現(xiàn)1例患者出現(xiàn)JAK2突變陽性。

目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡失調(diào)、造血微環(huán)境異常、免疫失調(diào)、表觀調(diào)節(jié)異常、染色體改變等因素參與MDS的發(fā)生發(fā)展［12-14］，其中，低危MDS表現(xiàn)為骨髓祖細(xì)胞凋亡的增加、進(jìn)展期MDS骨髓細(xì)胞凋亡減少而增殖增加［15］，提示隨著疾病進(jìn)展，克隆細(xì)胞獲得逃避凋亡信號的能力。因MDS/MPN患者整體預(yù)后較差［16］，作為比較本研究選取中高危MDS患者，通過凋亡研究發(fā)現(xiàn)其凋亡率約10.25%，符合大宗研究趨勢［17］，并且在中高危MDS患者中隨著骨髓原始細(xì)胞比例的增加，細(xì)胞凋亡減少。

Caspase-3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是外源性（死亡受體）和內(nèi)源性（線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）凋亡通路的共同凋亡蛋白酶［18］，激活后通過抑制多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的活性，進(jìn)而活化核酸內(nèi)切酶，裂解核小體間的DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［19］。本研究從形態(tài)學(xué)觀察和凋亡蛋白酶生物活性研究兩方面發(fā)現(xiàn)MDS患者骨髓單個核細(xì)胞凋亡發(fā)生率高于MDS/MPN患者，提示MDS/MPN是不同于MDS的另外一種血液系統(tǒng)克隆性疾病。

同時通過分析患者骨髓單個核細(xì)胞凋亡與患者臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，MDS患者中骨髓單個核細(xì)胞凋亡率與骨髓原始細(xì)胞比例呈反比，但MDS/MPN患者中BMNCs凋亡率卻與骨髓原始細(xì)胞比例呈正相關(guān)，考慮可能與以下因素相關(guān)：①MDS/MPN是獨立于MDS的一種髓系惡性腫瘤，細(xì)胞生物學(xué)活性不同于MDS克隆；②本研究病例數(shù)有限，尚需進(jìn)一步進(jìn)行臨床病例收集及研究。但本研究未發(fā)現(xiàn)患者細(xì)胞凋亡與其染色體核型異常、外周血細(xì)胞減少程度相關(guān)。

本研究從細(xì)胞分子水平初步比較了MDS與MDS/MPN兩類慢性髓系腫瘤中BMNCs的凋亡情況，并探討了骨髓細(xì)胞凋亡與患者臨床特征的相關(guān)性，為MDS及MDS/MPN的病理機制研究提供相關(guān)實驗依據(jù)。但MDS與MDS/MPN兩類疾病發(fā)病機制中存在共同及不同之處，細(xì)胞凋亡與增殖對MDS及MDS/ MPN患者的臨床表型、治療反應(yīng)和預(yù)后的影響等問題仍需要大量臨床及實驗室研究來解決。

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Comparison of apoptosis of bone marrow mononuclear cells and clinical features in patients with advanced MDS and MDS/MPN

LIU Xiaoliu1ZOU Lixin1LEIJian2ZHANG Shuhui1WU Jianxiong1
1.Department of Hematology，Changsha Hospital Affiliated to Hu'nan Normal University，Hu'nan Province，Changsha 410006，China；2.Department of Pathology，the Affiliated Tumor Hospital，Xiangya School of Medicine，Central South University，Hu'nan Province，Changsha410006，China

Objective To compare the apoptosis of bone marrow mononuclear cells （BMNCs）in myelodysplastic syndrome（MDS）and myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms（MDS/MPN），and analyze the relationship between apoptosis and clinical characteristics of patients.Methods Bone marrow specimens and clinical data of 8 cases of intermediate/high risk MDS and 5 cases of MDS/MPN patients were collected from July 2013 to July 2015 in Department of Hematology，Changsha Hospital Affiliated to Hu'nan Normal University.Acridine orange/ethidium bromide fluorescence staining and Caspase-3 activity assay were used to detect apoptosis of BMNCs，and the correlation between apoptosis and clinical characteristics of patients was analyzed.Results The apoptotic rate in intermediate/high risk MDSand MDS/MPN patients were（10.25±1.77）%，（6.90±1.66）%respectively，the former was higher than the latter（P= 0.032）.Caspase-3 activity assay showed that the Caspase-3 activity of intermediate/high risk MDSBMNCs was（0.18± 0.04）%，significantly higher than that of the MDS/MPN group［（0.07±0.02）%］，with statistically significant difference （P=0.028）.Correlation analysis showed that negative correlation was found between BMNCs apoptosis and bone marrow blast cell percentage in intermediate/high risk MDS patients（r=-0.81，P=0.015），but BMNCs apoptotic rate and the proportion of bone marrow blast cells was positively correlated in MDS/MPN patients（r=0.90，P=0.037）.Conclusion The apoptotic rate and Caspase-3 activity are significantly different in intermediate/high risk MDS and MDS/MPN，and there is a correlation between apoptotic rate and bone marrow blasts.

Myelodysplastic syndrome；Myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms；Apoptosis

R551.3

A

1673-7210（2016）01（b）-0004-04

2015-10-11本文編輯：程銘）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81500141）。

劉小柳（1983.1-），女，博士；研究方向：惡性血液病的分子機制。