高慧，汪洋，王敏（淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026）

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高效液相色譜法測(cè)定熟肉制品中5種合成色素

高慧，汪洋*，王敏
（淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026）

建立熟肉制品中5種合成色素的高效液相色譜法測(cè)定方法。熟肉制品經(jīng)過(guò)脫脂后提取色素，選擇樣品中5種色素的最大吸收波長(zhǎng)用高效液相色譜儀分析測(cè)定。在0.10μg/mL～50.0μg/mL線性范圍內(nèi)，所得5種合成色素的回歸方程均呈較好的線性關(guān)系（r＞0.999）。該方法的檢出限為0.035μg/mL～0.040μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.79%～1.30%之間。對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，絕對(duì)回收率在91.5%～101.0%之間。本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于熟肉制品中合成色素的測(cè)定。

熟肉制品；色素；脫脂；最大吸收波長(zhǎng)；高效液相色譜法

色素作為食品添加劑，可分為天然色素和人工合成色素兩大類［1］，天然色素來(lái)源自然、安全性較高。人工合成色素即用人工化學(xué)合成方法所制得的有機(jī)色素。色素本身無(wú)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但由于其色澤鮮艷，著色力強(qiáng)，色調(diào)多樣，成本低廉，能夠增加食物感官美和提高人們的食欲，在食品行業(yè)被廣泛應(yīng)用。研究表明，過(guò)量攝入人工合成色素對(duì)人體有致突變、致瀉性和致癌性。目前國(guó)標(biāo)GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》［2］中針對(duì)熟肉制品人工合成色素的檢測(cè)方法的專屬性不強(qiáng)，熟肉制品中脂肪、蛋白質(zhì)含量高，樣品難以提取，回收率低。本文在原有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上改進(jìn)了熟肉制品中合成色素的前處理方法和檢測(cè)條件，獲得滿意效果。

1　材料與方法

1.1儀器

e2695高效液相色譜儀：Waters；超純水機(jī)：美國(guó)millipore，Milli-Q Advantage A10；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；C-50抽濾器：北京眾意中和生物技術(shù)有限公司；G3垂融漏斗：江蘇省寶應(yīng)縣正茂玻璃廠；針式過(guò)濾頭：上海興亞凈化材料廠，0.45 μm；高速離心機(jī)：Thermo，Sorvall ST 16R；SZ-1型快速混勻器：江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；WHY-2型恒溫水浴振蕩儀：金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；HWS 26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司。

1.2試劑

色譜純甲醇（美國(guó)迪馬公司）；超純水（電導(dǎo)率＜0.10 S/m，25℃）。

檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW（E）100001a、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW（E）100003a、莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW（E）100002a、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW（E）100004a，以上4種標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為0.500 mg/mL，定值單位為中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW（E）100164，濃度值為1.00 mg/mL，定值單位北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司。

乙酸銨溶液（優(yōu)級(jí)純，天津市巴斯夫化工有限公司，0.02 mol/L）；海砂（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，先用10%體積濃度鹽酸溶液浸泡煮沸15 min，冷卻，用水洗至中性，再用50 g/L氫氧化鈉溶液煮沸15 min，冷卻，用水洗至中性，于105℃干燥，貯于具塞瓶中。）；石油醚（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠，30℃～60℃）；無(wú)水乙醇-氨水-水混合溶液（均為優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；10%體積濃度硫酸溶液（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鎢酸鈉溶液（分析純，天津市天津市化學(xué)試劑一廠，100 g/L）；聚酰胺粉（江蘇無(wú)錫化學(xué)試劑有限公司，200目）；甲醇-甲酸溶液（均為優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸溶液（分析純，上海試劑一廠，20%）。

1.3預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取粉碎試樣5 g于研缽中，加海砂少許研磨混勻，吹風(fēng)使試樣干燥。加入石油醚，渦旋，離心，棄去石油醚。殘?jiān)貜?fù)上述去脂過(guò)程3次，除去脂肪，吹干。脫脂后的試樣轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入30 mL無(wú)水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比），振蕩，離心，將上層液體倒入100 mL的錐形瓶中，再向離心管中加入10 mL無(wú)水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比），重復(fù)上述操作，反復(fù)多次至提取液無(wú)色為止。合并提取液于70℃水浴上濃縮至10 mL以下，依次加入硫酸溶液1.0 mL和100 g/L鎢酸鈉溶液1.0 mL，混勻，繼續(xù)70℃水浴加熱5 min，沉淀蛋白質(zhì)。取下錐形瓶，冷卻至室溫，用濾紙過(guò)濾，少量水洗滌濾紙，濾液收集與100 mL燒杯中。

1.4色素提取

用檸檬酸溶液將依法制成的樣品溶液調(diào)pH值到6，加熱至60℃，加入適量的聚酰胺粉調(diào)成粥狀，以G3垂融漏斗抽濾，用60℃pH=4的水洗滌3次～5次，然后用甲醇-甲酸溶液（6∶4，體積比）洗滌3次～5次，再用水洗至中性，用無(wú)水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）解吸3次～5次，每次5 mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加超純水溶解，定容至5mL。經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，供HPLC測(cè)定。

1.5高效液相色譜法的測(cè)定

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

準(zhǔn)確吸取檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、500.0 μL；誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.50、1.50、5.0、15.0、50.0、250.0 μL置于5 mL容量瓶中，用超純水稀釋到刻度，得到0.10、0.30、1.0、3.0、10.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.5.2色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：檸檬黃428nm、日落黃483nm、誘惑紅507nm、胭脂紅509nm、莧菜紅521 nm；流動(dòng)相及梯度（A：色譜純甲醇；B：0.02 mol/L乙酸銨溶液）。梯度如表1。

表1　流動(dòng)相梯度Table 1　The gradients of mobile phase

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理方法

2.1.1樣品提取條件的優(yōu)化

首先用石油醚對(duì)樣品進(jìn)行脫脂，減少了脂肪對(duì)溶出色素的影響，結(jié)果提高了樣品的回收率和重現(xiàn)性。利用無(wú)水乙醇-氨水-水溶液作為提取溶劑，能夠提高色素的溶出度，同時(shí)減少蛋白溶出的影響［3］。

2.1.2聚酰胺粉的使用量

聚酰胺是具有酸堿二極性的化合物，在酸性條件下與水溶性酸性染料結(jié)合，而與天然色素、淀粉等物質(zhì)分離。聚酰胺粉的使用量根據(jù)樣品中色素的含量而改變［4］。一般樣品用1 g的聚酰胺粉調(diào)成糊狀即可，色素含量高的樣品，可以減少樣品量或者增加聚酰胺粉的使用量。

2.1.3無(wú)水乙醇-氨水-水的用量

預(yù)處理中首次加入30 mL無(wú)水乙醇-氨水-水體積比為7∶2∶1提取，色素含量小于等于0.15 g/kg的樣品再次各加入10 mL無(wú)水乙醇-氨水-水體積比為7∶2∶1提取3次即可，色素含量大于0.15 g/kg的樣品需重復(fù)提取4次。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

2.2.1色素的化學(xué)性質(zhì)

檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅均為水溶性酸性染料，結(jié)構(gòu)中含有不同數(shù)量的苯磺酸基，在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收特征［5］。本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，在200 nm～700 nm之間對(duì)5種合成色素進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)λmax如下：檸檬黃428 nm、日落黃483 nm、莧菜紅521 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅507 nm。

2.2.2波長(zhǎng)λ254下各色素的響應(yīng)值

GB/T 5009.35-2003采用的是λ254時(shí)進(jìn)行色素檢測(cè)，因此取10.0 μg/mL的5種色素的混標(biāo)20 μL，在λ254下按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，各色素的響應(yīng)值色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　5種色素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1　Chromatogram of 5 kinds of pigment standard

5種色素的檢測(cè)限為檸檬黃0.050 μg/mL、日落黃0.050 μg/mL、莧菜紅0.040 μg/mL、胭脂紅0.040 μg/mL、誘惑紅0.055 μg/mL。

2.2.3最大吸收波長(zhǎng)λmax下各色素的響應(yīng)值

用PDA檢測(cè)器對(duì)5種合成色素進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以同時(shí)5個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，即同一時(shí)間測(cè)定5個(gè)波長(zhǎng)的響應(yīng)值。取10.0 μg/mL的5種色素的混標(biāo)20 μL，按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，各色素的響應(yīng)值色譜圖見(jiàn)圖2～圖6。

圖2　檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖Fig.2　Chromatogram of Tartrazine standard

圖3　胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖Fig.3　Chromatogram of Ponceau 4R standard

圖4　日落黃標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖Fig.4　Chromatogram of Sunset yellow standard

圖5　莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖Fig.5　Chromatogram of Amranth standard

圖6　誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖Fig.6　Chromatogram of Allura red standard

5種色素在最大吸收波長(zhǎng)下的檢出限為檸檬黃0.035 μg/mL、日落黃0.035 μg/mL、莧菜紅0.040 μg/mL、胭脂紅0.040 μg/mL、誘惑紅0.035 μg/mL?？梢?jiàn)選擇最大吸收波長(zhǎng)時(shí)，5種色素的靈敏度顯著提高，響應(yīng)值增加了1到1.6倍，峰形更加尖銳，降低了方法的檢出限。

2.3線性范圍和檢出限

分別取5種色素的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列20 μL，按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，可測(cè)得5種色素6個(gè)濃度響應(yīng)值峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見(jiàn)表2。

表2　5種色素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2　Linearity range，calibration curve，correlation and detection limit of five pigment

從表2可以看出，5種合成色素的線性關(guān)系良好。以3倍基線噪音確定檢出限濃度。

2.4方法準(zhǔn)確度、精密度和回收率測(cè)定

在臘腸、火腿腸、紅腸樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)高、中、低3個(gè)濃度的色素標(biāo)液，每一個(gè)濃度平行制作6份，連續(xù)6 d，按照1.3、1.4樣品處理進(jìn)行試驗(yàn)，考察方法的日內(nèi)、日間精密度及絕對(duì)回收率。試驗(yàn)結(jié)果列于表3～表5中。

表3　臘腸樣品加標(biāo)試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3　Experimental data of spiked Sausage samples

表4　火腿腸樣品加標(biāo)試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 4　Experimental data of spiked ham sausage samples

以上試驗(yàn)結(jié)果RSD值均＜1.5%，精密度和絕對(duì)回收率結(jié)果令人滿意。

2.5樣品分析結(jié)果

分別取臘腸、火腿腸、紅腸各10份樣品進(jìn)行檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅5種色素測(cè)定。稱取5 g樣品按照1.3進(jìn)行樣品預(yù)處理，再按照1.4進(jìn)行色素提取，進(jìn)樣20 μL于高效液相色譜儀中進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果如下：臘腸中胭脂紅檢出率為20%，誘惑紅檢出率為10%，其他3種色素未檢出，均未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，合格率100%；火腿腸中誘惑紅檢出率為40%，1份超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，超標(biāo)率10%，其他4種色素未檢出；紅腸中胭脂紅檢出率10%，誘惑紅檢出率為60%，均未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，合格率100%。

表5　紅腸樣品加標(biāo)試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 5　Experimental data of spiked red-sausage samples

3　小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件，樣品經(jīng)過(guò)石油醚脫脂后、利用無(wú)水乙醇-氨水-水溶液作為色素溶出劑，溶出后過(guò)濾、提取色素，選擇熟肉制品中5種色素的最大吸收波長(zhǎng)用高效液相色譜儀分析測(cè)定，分辨率高，靈敏度高，檢出限低，測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，可作為檢測(cè)熟肉制品中合成色素的一種準(zhǔn)確、可行的分析方法。

［1］宋丹萍，張宏，李琪.國(guó)內(nèi)外食用色素標(biāo)準(zhǔn)的比較及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2014，35（3）:295-300

［2］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.35-2003食品中著色劑的測(cè)定方法［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004

［3］王紅梅，郭偉，王繼鵬，等.高效液相色譜法測(cè)定肉制品中食用合成色素的含量［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28（6）:106-108

［4］王紅青，潘向榮，姜荷，等.糖果中6種合成色素液相色譜檢測(cè)方法的改進(jìn)［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（2）:297-298，389

［5］管敏婭，張立義.食品中5種合成食用色素高效液相色譜檢測(cè)方法的探討［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（6）:1105-1106，1111

Improvement of 5 Synthetic Pigment with HPLC Method for the Determination of Cooked Meat Products

GAO Hui，WANG Yang*，WANG Min
（Zibo Center for Disease Control and Prevention，Zibo 255026，Shandong，China）

To establish a HPLC method for the determination of 5 kinds of synthetic pigment in cooked meat products，the selection of the maximum absorption wavelength of 5 synthetic pigment in the samples was determined by high performance liquid chromatography analysis，after the degreasing of the cooked meat products and the pigment extraction.The obtained regression equations of 5 kinds of synthetic pigment showed a good linear relationship（r＞0.999）in 0.10 μg/mL-50.0 μg/mL linear range，with the detection limit of 0.035 μg/mL-0.040 μg/mL，and the relative standard deviation was between 0.79%to 1.30%.The samples were spiked with recovery experiment，and the absolute recoveries were in the range of 91.5%-101.0%.The method is simple，rapid，accurate，which is suitable for determination of the synthetic pigment in cooked meat products.

cooked meat products；pigment；degreasing；maximum absorption wavelength；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.033

高慧（1979—），女（漢），主管技師，學(xué)士，研究方向：食品理化檢測(cè)。

汪洋，男，主管技師，碩士，研究方向：食品理化和環(huán)境檢測(cè)。

2015-04-14