陳金娥，賀佩，張海容（忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

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β-環(huán)糊精增敏-紫外分光光度法測(cè)定啤酒中異α-酸

陳金娥，賀佩，張海容*
（忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

啤酒花是一種重要的風(fēng)味劑，也是釀造啤酒的重要原料。本文采用紫外分光光度法測(cè)定了6種不同品牌啤酒中異-酸（iso-α-酸）的含量。試驗(yàn)考察了不同表面活性劑、介質(zhì)酸度對(duì)iso-α-酸紫外吸收的影響。結(jié)果表明：iso-α-酸在258 nm處有較強(qiáng)的吸收，方法線性范圍在10 μg/mL～50 μg/mL，相關(guān)系R=0.999 4，RSD=1.40%（n=5）。通過比較說明β-環(huán)糊精（β-CD）對(duì)iso-α-酸的增敏作用最強(qiáng)，SDS次之，曲拉通-100最弱。6種不同品牌啤酒中iso-α-酸的含量（μg/mL）依次為：司陶特黑啤酒（130.33）＞燕京啤酒（67.45）＞哈爾濱啤酒（58.14）＞嶗山啤酒（39.62）＞純生啤酒（38.76）＞雪花啤酒（35.53）。用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定其回收率，樣品回收率范圍在96.30%～104.70%之間，結(jié)果滿意。

啤酒；異α-酸；β-CD；紫外分光光度法

啤酒花［1］學(xué)名蛇麻（Lumpulus L.），又名Hop，香蛇麻花、酒花、野酒花，為?？撇輰俣嗄晟试荼局参铮菩郛愔?，單花性，雄性球穗花序簡(jiǎn)稱酒花。它是一種較耐旱不耐熱的植物，主要分布于我國(guó)西北地區(qū)、新疆北部、東北、華東、及山東、甘肅、陜西等地。酒花成分很復(fù)雜，文獻(xiàn)報(bào)道［2-3］啤酒花中含有十幾類化學(xué)物質(zhì)，其中包括樹脂類、揮發(fā)油、黃酮類、鞣質(zhì)、膽堿、粗纖維、氨基酸等多種化學(xué)成分。正是由于啤酒花中大量功效成分的存在，啤酒花提取物及其復(fù)方制劑具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜、雌性激素樣等多種生物活性。德國(guó)人首先在釀制啤酒時(shí)添加了酒花，從而使啤酒具有了清爽的苦味和芬芳的香味。酒花被譽(yù)為“啤酒的靈魂”，成為啤酒釀造不可缺少的主要原料之一。啤酒花的有效成分是酒花樹脂α-酸［4-5］，由于α-酸的?；酗柡蜔N側(cè)鏈不同，分別含有3種不同組分：共葎草酮、律草酮和近葎草酮。啤酒在發(fā)酵過程中，α-酸轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的iso-α-酸（反應(yīng)見圖1），不僅苦味度增加，而且其對(duì)光的穩(wěn)定性也有較大的改善。

圖1　α-酸和iso-α-酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical structure of α-acid and iso-α-acid

目前，測(cè)定啤酒花中α-酸的主要方法有高效液相色譜法［6-7］，電導(dǎo)滴定法［8］、薄層色譜法［9］等。雖然高效液相色譜方法測(cè)定的準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性較好，但儀器昂貴、操作復(fù)雜。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，采用紫外分光光度法測(cè)定相關(guān)iso-α-酸研究報(bào)道比較少見。

本研究工作采用紫外分光光度法，探討了不同表面活性劑、酸度對(duì)iso-α-酸紫外吸收的影響，測(cè)定了市場(chǎng)上6種品牌啤酒中iso-α-酸含量［10］，對(duì)不同人群選擇市場(chǎng)中自己喜愛的風(fēng)味啤酒飲品有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

1　材料與方法

1.1儀器

UV-2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；pHS-3TC（0.01級(jí)）精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；JJ-1精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器：金壇市榮華儀器制造有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化科技公司；AB204-N型電子分析天平：Mettler-Toleclo Group公司。

1.2試劑與材料

甲醇（≥99.5%）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氫氧化鈉：天津市北辰方正試劑廠；碳酸氫鈉：北京化學(xué)試劑公司；甲苯：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸：太原化肥廠化學(xué)試劑廠；磷酸：天津市化學(xué)試劑三廠；乙酸：天津市化學(xué)試劑二廠；硼酸：天津市北辰方正試劑廠；40%啤酒花浸膏：甘肅天工生物科技有限公司；Brij35（聚氧乙烯月桂醚）：Alfa Aesar公司；SDS（十二烷基硫酸鈉，分析純）：Sigma公司；TritonX-100（曲拉通X-100，化學(xué)純）：北京化學(xué)試劑公司；β-CD（β-環(huán)糊精）：西安宏昌藥業(yè)有限公司；CTMAB（溴化十六烷基三甲銨，分析純）：北京化學(xué)試劑公司。所用試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水。

三酸緩沖液的配制：用0.68 mL 81%的正磷酸、0.59 mL乙酸、0.62 g硼酸可配成250 mL三酸溶液，再用0.2 mol/L的NaOH溶液調(diào)制成所需pH緩沖溶液。

燕京啤酒、青島啤酒、司陶特黑啤酒、哈爾濱啤酒、嶗山啤酒、雪花啤酒：均購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

本試驗(yàn)選用典型的5種表面活性劑：陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉［11］（SDS）；陽離子表面活性劑溴化十六烷基三甲銨（CTMAB）；非離子表面活性劑曲拉通-100（TritonX-100）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）；超分子化合物β-環(huán)糊精（β-CD）。各表面活性劑的臨界膠束濃度見表1。

表1　表面活性劑的臨界膠束濃度（CMC）Table 1　The critical micelle concentration of surfactants

從實(shí)際效果考慮，配制表面活性劑大于臨界膠束濃度，所配制SDS液濃度為1.0×10-1mol/L，CTMAB液濃度為1.0×10-2mol/L，曲拉通X-100液濃度為3.0× 10-4mol/L，Brij-35的工作液濃度為1.0×10-3mol/L。準(zhǔn)確稱取β-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品1.135 0 g，用二次蒸餾水溶解，定容到100 mL，濃度為1.0×10-2mol/L的工作液。iso-α-酸配制成100 μg/mL工作液。

1.3方法

1.3.1啤酒花浸膏中α-酸的提取與異構(gòu)化［7］

稱取5.095 1 g的酒花浸膏，用NaHCO3清洗，傾去廢液，置于帶攪拌及滴液漏斗的三頸燒瓶中，把1 mL 5%NaOH溶液稀釋到20 mL，加入到三頸燒瓶中，在水浴中加熱并攪拌，溫度控制在50℃左右，繼續(xù)滴加5%的NaOH溶液，使其pH達(dá)8.5～9。用鹽酸將濾液酸化，再用甲苯將析出的α-酸萃取出來，用分液漏斗分開，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上得到α-酸（60℃），稱量得1.4698g，備用。

稱取0.5 g α-酸于500mL的燒杯中，置50℃水浴，不斷攪拌使α-酸全部溶解后（約5 min），加入MgCl2甲醇溶液，同時(shí)用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，然后轉(zhuǎn)入500 mL的圓底燒瓶，保持90℃完成異構(gòu)化反應(yīng)。冷卻至室溫，在用HCl酸化至pH＜2，用甲苯萃取析出的iso-α-酸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)溶劑得到iso-α-酸。

1.3.2iso-α-酸紫外吸收測(cè)定

分別用移液管吸取1 mL100 μg/mL iso-α-酸工作液或樣品，依次加入一定體積β-CD、緩沖溶液于10 mL比色管中，定容，在紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸收。

2　結(jié)果與討論

2.1iso-α-酸的紫外光譜研究

按試驗(yàn)方法，在200 nm～400 nm范圍內(nèi)分別掃描α-酸及iso-α-酸的紫外吸收，掃描結(jié)果見圖2。

圖2　iso-α-酸在甲醇中的紫外吸收光譜Fig.2　Ultraviolet spectrum of iso-α-acids in methnol

由圖2可知，α-酸的最大吸收波長(zhǎng)在231、328 nm處，iso-α-酸在258 nm處，兩者紫外吸收有較大的變化。本文選擇258 nm作為iso-α-酸測(cè)量波長(zhǎng)。

2.2不同表面活性劑對(duì)iso-α-酸紫外吸收的影響

表面活性劑，是指具有固定的親水親油基團(tuán)，在溶液的表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質(zhì)。雙親表面活性劑的獨(dú)特結(jié)構(gòu)決定了它有獨(dú)特的性能，獨(dú)特的性能使得它有特殊的應(yīng)用。表面活性劑使iso-α-酸的水溶性增大，紫外吸收增強(qiáng)。

本文選用了十二烷基硫酸鈉（SDS），溴化十六烷基三甲銨（CTMAB），曲拉通X-100（TritonX-100），聚氧乙烯月桂醚（Brij-35），β-環(huán)糊精（β-CD）作表面活性劑，考察了它們對(duì)iso-α-酸紫外吸收的影響，如表2。

表2　不同表面活性劑對(duì)iso-α-酸紫外吸收的影響Table 2　Effect of different surfactants on Ultraviolet absorption of iso-α-acids

試驗(yàn)表明，不同表面活性劑對(duì)iso-α-酸紫外吸收有較大的影響，吸收值大小順序?yàn)椋害?CD＞SDS＞Brij-35＞CTMAB＞TritonX-100，iso-α-酸溶于β-CD中吸收最大，本文選擇β-CD作增敏劑。

2.3酸度對(duì)iso-α-酸紫外吸收的影響

pH值對(duì)iso-α-酸的紫外吸收影響見圖3。

圖3　pH對(duì)iso-α-酸的紫外吸收影響Fig.3　Effect of pH on ultraviolet absorption of iso-α-acids

由圖3可知，iso-α-酸在酸性條件下的吸收隨pH值的增大而減小，在pH值約為8.1時(shí)吸收值最小，之后隨著pH值的增大又略有增大趨勢(shì)。本文選擇pH= 3.2三酸緩沖液控制測(cè)量體系酸。

2.4工作曲線

準(zhǔn)確量取一定濃度iso-α-酸溶液于10 mL比色管中，用二次水定容到刻度，在258 nm波長(zhǎng)處測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值，在10 μg/mL～50 μg/mL范圍內(nèi)吸收值與iso-α-酸量呈良好的線性關(guān)系，如圖4。

回歸方程為：A=0.2694C+0.0278（C的單位：μg/mL），線性相關(guān)系R=0.999 4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.40%（n=5）。

2.56種不同品牌啤酒中iso-α-酸含量測(cè)定及回收率

iso-α-酸作為啤酒風(fēng)味原料之一的關(guān)鍵性成分，通過紫外吸收法測(cè)其含量、作為評(píng)價(jià)啤酒質(zhì)量、苦味度簡(jiǎn)單、方便，可以滿足不同風(fēng)味喜好人群需求。試驗(yàn)分別取樣品液1 mL，按試驗(yàn)方法測(cè)定種不同品牌啤酒中iso-α-酸含量，同時(shí)按標(biāo)準(zhǔn)加入法加入不同量標(biāo)樣iso-α-酸（20 μg），測(cè)定6種不同品牌啤酒中iso-α-酸的回收率，詳細(xì)結(jié)果見表3。

6種不同品牌啤酒中iso-α-酸的含量順序?yàn)椋核咎仗睾谄【疲狙嗑┢【疲竟枮I啤酒＞嶗山啤酒＞純生啤酒＞雪花啤酒。回收率的范圍在96.30%～104.70%之間，用紫外吸收法測(cè)定iso-α-酸含量，方法簡(jiǎn)便、可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。

表3　不同品牌啤酒中iso-α-酸的含量及回收率Table 3　The contents and recoveries of iso-α-acid in beers

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Determination of Iso-α-acids in Beer with β-CD Sensitized by Ultraviolet Spectrophotometry

CHEN Jin-e，HE Pei，ZHANG Hai-rong*
（Lab of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Hops is a kind of important flavour enhancer and raw material of brewing industry.In this article，iso-α-acid content in beer with 6 different brands were measure d through ultraviolet spectrophotometry.The effects of the different surfactants，medium acidity on absorption of α-acid were explored.The results showed that the α-acid had the strong absorption at 258 nm，the linear range of 10 μg/mL to 50 g/mL，correlation coefficent R=0.999 4，the RSD=1.40%（n=5），respectively.The sensitized action with different surfactants for α-acid absorption were as follows：β-CD，the SDS，Brij-35，TritonX-100 and CTMAB.The iso-α-acid contents（g/mL）in beer with 6 different brands were Si Tao Te Hei（130.33）＞Yanjing beer（67.45）＞Harbin beer（58.14）＞Laoshan beer（39.62）＞Yanjing pure draft beer（38.76）＞Snow Flower beer（35.53）.The average recoveries were in the range of 96.30%-104.70%with standard addition method，the results had been satisfied for sample determination.

beer；iso-α-acid；β-CD；ultraviolet spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.028

忻州師范學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助計(jì)劃（xk201402）；山西省教育廳重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目（20141010）；山西省高等學(xué)校教學(xué)改革項(xiàng)目（2015-100）

陳金娥（1957—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科，研究方向：天然植物分離及分析。

張海容（1957—），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師。

2015-06-20