索 磊，楊印祥，欒 佐

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·論著·

·方法學(xué)研究·

含人LINGO-1慢病毒干擾載體的構(gòu)建與鑒定

索 磊，楊印祥，欒 佐

目的體外構(gòu)建含人LINGO-1慢病毒干擾載體，并測定其對靶基因LINGO-1的干擾效應(yīng)。方法2015年3—11月，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的人LINGO-1基因序列，設(shè)計合成針對人LINGO-1短發(fā)夾RNA(LINGO-1 shRNA)干擾序列，并將其克隆至重組質(zhì)粒載體，測序驗證后在293T細胞內(nèi)包裝慢病毒并測定病毒滴度。將慢病毒載體分為目標(biāo)基因干擾載體組(實驗組)和錯配序列干擾載體組(對照組)，并轉(zhuǎn)染至人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251，熒光顯微鏡下觀察其感染效率,并采用免疫熒光染色、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)法檢測LINGO-1 mRNA表達水平，采用Western blotting法檢測LINGO-1表達水平。結(jié)果成功構(gòu)建兩組慢病毒干擾載體，經(jīng)過包裝分別得到滴度為2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒載體感染人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251后，實驗組和對照組載體轉(zhuǎn)染效率分別為96.6%、95.2%。免疫熒光染色顯示，人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251高表達LINGO-1，經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，實驗組免疫熒光呈現(xiàn)減弱現(xiàn)象。實驗組LINGO-1 mRNA表達水平(0.09±0.01)較對照組的(1.00±0.00)降低(t=12.87，P<0.01)，實驗組LINGO-1 mRNA相對表達抑制率為91.0%。實驗組LINGO-1表達水平(0.28±0.02)較對照組的(1.00±0.00)降低(t=-8.13,P<0.01)。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了含人LINGO-1 shRNA干擾載體，并證實了干擾載體對靶基因有較好的干擾效果，為研究LINGO-1在軸突再生中的作用奠定了基礎(chǔ)。

慢病毒屬；RNA干擾；LINGO-1

索磊，楊印祥，欒佐.含人LINGO-1慢病毒干擾載體的構(gòu)建與鑒定[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(24)：2962-2966.[www.chinagp.net]

SUO L,YANG Y X,LUAN Z.Construction and identification of lentiviral interference vector that including human LINGO-1[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2962-2966.

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后如何有效地促進神經(jīng)元的軸突再生、突觸形成，已經(jīng)成為當(dāng)前神經(jīng)再生領(lǐng)域研究的熱點，近年來研究發(fā)現(xiàn)，LINGO-1在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷動物模型中表達明顯升高，其可能在神經(jīng)再生過程中發(fā)揮了重要的負調(diào)控作用[1-2]；而RNA干擾(RNA inference,RNAi) 作為一種新興基因治療手段,能夠特異性抑制目的基因的表達，為進一步研究LINGO-1在調(diào)控神經(jīng)元增殖和分化的發(fā)生、發(fā)展中的功能機制提供了新的研究方法[3-4]。國內(nèi)關(guān)于LINGO-1基因的研究主要集中在動物源細胞實驗研究[5]。本實驗設(shè)計構(gòu)建了針對人LINGO-1短發(fā)夾RNA(LINGO-1 shRNA)的慢病毒載體，并檢測其對人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251 LINGO-1基因的干擾效率，為后續(xù)探究人LINGO-1拮抗性實驗研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251、慢病毒干擾載體〔pGCSIL-綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒〕及慢病毒包裝系統(tǒng)均由北京溯源精微科技有限公司提供；其他主要實驗材料包括質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega公司)，AgeⅠ、EcoRⅠ內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶(NEB公司)，瓊脂糖(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基及高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，β甘油磷酸鈉、二磷酸維生素C、地塞米松(Sigma公司)，胎牛血清(HyCione公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(Sigma公司)及LINGO-1一抗和二抗(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)2015年3—11月，人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251使用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，貼壁生長，3～4 d傳代一次。

1.2.2含人LINGO-1 shRNA慢病毒載體構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的人LINGO-1基因序列(NM_001301186.1)，設(shè)計、合成LINGO-1 shRNA序列以及無靶向隨機打散序列(LINGO-ctl)，LINGO-1上游引物為5′-CCGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTCGAGGGAAGTCCTT

GAACTCCTTGCTTTTTG-3′，下游引物為5′-AATTCAAAAAG

CAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTCGAGGGAAGTCCTTGAACTCC

TTGC-3′；LINGO-ctl上游引物為5′-CCGGGCGAGAAGTT

CATCGTTATCCCTCGAGGGATAACGATGAACTTCTCGCTTTTTG

-3′，下游引物為5′-AATTCAAAAAGCGAGAAGTTCATCGTT

ATCCCTCGAGGGATAACGATGAACTTCTCGC-3′。采用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ對兩對載體框架及慢病毒載體pGCSIL-GFP進行雙酶切(37 ℃，過夜),酶切后將干擾載體框架與干擾載體進行連接(16 ℃，過夜),形成重組干擾載體pGCSIL-GFP-LINGO-1。

1.2.3重組干擾載體的轉(zhuǎn)化、PCR鑒定及測序取2 μl連接產(chǎn)物加入200 μl大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5a，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，快速冰浴2 min，加入800 μl SOC培養(yǎng)液混勻，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)45 min，取150 μl已轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5a，均勻涂布于含氨芐霉素(Amp)抗性(100 μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)平板，37 ℃培養(yǎng)16 h。然后進行陽性克隆的PCR鑒定,挑選陽性單克隆菌液送公司測序(上海美季生物技術(shù)有限公司進行ABI3733型測序儀測序分析)。

1.2.4病毒包裝及病毒滴度測定將轉(zhuǎn)染混合物(稀釋后的DNA與轉(zhuǎn)染試劑混合)滴加到293T細胞培養(yǎng)液中，搖勻，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h，采用熒光顯微鏡觀察含標(biāo)簽熒光(GFP/RFP)細胞的數(shù)量，判定轉(zhuǎn)染效率，確定轉(zhuǎn)染成功后(GFP熒光細胞比例≥90.0%)，進行收毒操作，收集含重組慢病毒的細胞上清液，過濾、濃縮，置-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用逐孔倍比稀釋?10倍)，將病毒原液感染293T細胞后,進行病毒滴度測定。細胞轉(zhuǎn)染72 h后在熒光顯微鏡下觀察含有目的病毒標(biāo)記的細胞數(shù)(GFP)，計數(shù)病毒滴度。

1.2.5慢病毒載體對LINGO-1基因表達干擾效率的檢測人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251接種于48孔板中，2×104個細胞/孔，接種24 h后進行慢病毒轉(zhuǎn)染；實驗分為兩組：目標(biāo)基因干擾載體組(實驗組)和錯配序列干擾載體組(對照組)；轉(zhuǎn)染用重組病毒液感染復(fù)數(shù)(MOI)為100。轉(zhuǎn)染后12 h更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染3 d后應(yīng)用熒光顯微鏡測定各組細胞的載體轉(zhuǎn)染效率,載體轉(zhuǎn)染效率(%)=(GFP陽性細胞數(shù)/所測細胞總數(shù))×100%；若GFP陽性細胞數(shù)比例大于95.0%，則繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，收集細胞分別行免疫熒光染色、實時熒光定量PCR(qPCR)、Western blotting法檢測。

1.2.6qPCR法檢測LINGO-1 mRNA表達水平收集人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251轉(zhuǎn)入無RNA酶的PCR管中，加入1 ml Trizol試劑，冰上反應(yīng)5 min后置于-80 ℃冰箱備用；經(jīng)RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，SYBRGreenⅠ法進行qPCR。LINGO-1上游引物為5′-TCTCCTACAACCCCATCAGC-3′，下游引物為5′-TTGCCAGAGACATTGAGCAC-3′；hACTB上游引物為5′-TGCGCAGAAAACAAGATGAG-3′，下游引物為5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；75 ℃退火10 min。置于4 ℃保存?zhèn)溆?。擴增產(chǎn)物上樣電泳，凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行掃描分析。采用2-ΔΔCt方法分析基因相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.7Western blotting法檢測LINGO-1表達水平貼壁人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251，洗滌后，加入適量RIPA裂解液(約細胞體積6倍)，裂解5～10 min，轉(zhuǎn)至1.5 ml EP中，孵育1.5 h充分裂解后，12 000×g離心10 min，取上清液，即為蛋白提取物。各組樣品，取上清液測定并記錄蛋白濃度后置于-80 ℃冰箱凍存。定量蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，100 V電壓轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加Anti-LINGO-1一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12 h后，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的對應(yīng)二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯影，定影。運用Image J軟件分析目的條帶灰度值(β-actin標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參對照)，計算LINGO-1相對值表達量。實驗重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1重組干擾載體的轉(zhuǎn)化、PCR鑒定及測序重組干擾載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5a后,陽性克隆PCR擴增,其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測定,表達特異性條帶 (見圖1)。上述結(jié)果說明,合成的干擾載體框架被成功連接到慢病毒載體中。質(zhì)粒測序結(jié)果表明,重組載體序列與合成的干擾載體框架完全一致(見圖2，本文彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件),可進一步說明重組干擾載體構(gòu)建是成功的。

注：shRNA=短發(fā)夾RNA

圖1重組干擾載體的PCR鑒定

Figure 1PCR identification of recombinant virus vectors

圖2　LINGO-1-shRNA質(zhì)粒測序結(jié)果

2.2病毒包裝及病毒滴度測定質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察含標(biāo)簽熒光(GFP/RFP)細胞的數(shù)量，經(jīng)計算轉(zhuǎn)染效率高達95.0%以上(見圖3)。收集病毒原液后,經(jīng)逐孔稀釋法滴度測定,重組慢病毒均獲得了較高的滴度,分別為2×108TU/ml和4×108TU/ml，符合后續(xù)實驗要求。

2.3人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251病毒載體感染及干擾效率目標(biāo)基因干擾載體和錯配序列干擾載體轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251后(MOI值100)，24 h后鏡下GFP呈弱陽性，轉(zhuǎn)染第3天后GFP呈強陽性(見圖4)。實驗組和對照組載體轉(zhuǎn)染效率分別為96.6%、95.2%。

2.4免疫熒光染色LINGO-1表達情況免疫熒光染色顯示，人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251高表達LINGO-1，經(jīng)干擾載體轉(zhuǎn)染干擾后，實驗組免疫熒光呈現(xiàn)減弱現(xiàn)象，可間接表明實驗組LINGO-1表達量較對照組有所減少(見圖5)。

2.5qPCR法檢測LINGO-1 mRNA表達水平實驗組LINGO-1 mRNA表達水平為(0.09±0.01)，對照組為(1.00±0.00)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.87，P<0.01)。實驗組LINGO-1 mRNA相對表達抑制率為91.0%。

2.6Western boltting法檢測LINGO-1表達水平實驗組LINGO-1表達水平為(0.28±0.02)，對照組為(1.00±0.00)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-8.13，P<0.01，見圖6)。

注：A、C為明場293細胞，B、D為帶GFP熒光細胞

圖3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率(×100)

Figure 3Transfection efficiency of plasmid

注：A：實驗組GFP病毒感染，B：實驗組4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，C：實驗組Merge圖，D：對照組GFP病毒感染，E：對照組DAPI染核，F(xiàn)：對照組Merge圖

圖4人膠質(zhì)細胞瘤細胞U251病毒載體感染(×200)

Figure 4Lentiviral vectors transfected into in U251 cells of human glioma

注：A：實驗組LINGO-1熒光染色，B：實驗組DAPI染核，C：實驗組Merge圖，D：對照組LINGO-1熒光染色，E：對照組DAPI染核，F(xiàn)：對照組Merge圖

圖5LINGO-1免疫熒光染色(×200)

Figure 5LINGO-1 immunofluorescence staining

圖6　Western boltting法檢測LINGO-1表達水平電泳圖

Figure 6Electrophoretogram of expression level of LINGO-1 protein by Western blotting method

3　討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病包括缺氧缺血性腦病、創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、運動神經(jīng)元疾病等，是一類嚴重威脅人類健康的疾病。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)元永久性死亡、軸突崩解及髓鞘脫失，而神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)過程又十分復(fù)雜，其中中樞神經(jīng)生長微環(huán)境是影響神經(jīng)元、軸突再生的一個關(guān)鍵因素[6]。因此，近年來從神經(jīng)再生微環(huán)境著手，如何有效促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷神經(jīng)的再生，尋找促進軸突再生的有效靶點成為研究的新方向[7]。研究者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多種神經(jīng)再生抑制性因子在神經(jīng)再生過程中發(fā)揮著重要的作用[8]；而LINGO-1就是其中一個典型代表，LINGO-1是一個由614個氨基酸組成的跨膜蛋白，早期研究發(fā)現(xiàn)LINGO-1可以抑制軸突生長[9]；近年來動物實驗研究表明，LINGO-1在神經(jīng)元軸突的髓鞘化過程中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[10-12]，LINGO-1是成髓鞘細胞分化和髓鞘化的一個關(guān)鍵的負調(diào)節(jié)因素[13]。因此，若人源細胞中LINGO-1表達下調(diào)也可能會對中樞神經(jīng)再生產(chǎn)生重要的影響作用。

慢病毒載體主要是由人類免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency virus,HIV)發(fā)展改造而來，其對感染靶細胞的細胞周期要求低，感染靶細胞后不但可以長期穩(wěn)定表達，而且不會產(chǎn)生生物危害。一般根據(jù)實驗需要對慢病毒載體進行改造，通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi進行腫瘤疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究[14-15]；RNAi作為一種新興基因治療手段,能夠特異性抑制目的基因的表達效果[3-4]。

本研究根據(jù)LINGO-1基因的特異性,通過慢病毒干擾載體降低人源U251細胞LINGO-1的表達。采用分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用慢病毒作為RNAi的載體,通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了人LINGO-1基因重組慢病毒干擾載體,重組載體經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR鑒定及DNA測序，證實插入序列與設(shè)計的shRNA寡聚核苷酸序列完全一致，證明成功構(gòu)建重組載體，進一步包裝后，獲得了高純度的病毒原液；且LINGO-1 RNAi載體帶有綠色熒光蛋白基因，便于慢病毒包裝時轉(zhuǎn)染效率的測定及對靶細胞U251感染效率的評估，實驗結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率均在95.0%以上。慢病毒感染U251細胞3 d后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組和對照組細胞內(nèi)均可見大量綠色熒光，經(jīng)計算GFP陽性細胞數(shù)分別為96.6%和95.2%，初步判定感染靶細胞成功。為驗證所構(gòu)建的干擾載體對U251細胞中LINGO-1基因表達的干擾效果，分別運用免疫熒光染色、qPCR和Western blotting法進行了檢測。在qPCR檢測中，采用了相對定量比較CT值法，計算結(jié)果得出實驗組LINGO-1 mRNA表達水平明顯低于對照組，基因沉默效率高達91.0%。Western blotting法檢測LINGO-1表達水平，結(jié)果顯示，實驗組LINGO-1表達水平明顯低于對照組；免疫熒光染色間接證明實驗組LINGO-1表達有所減少。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建含人LINGO-1慢病毒干擾載體對人源靶基因LINGO-1表達具有顯著的抑制作用，為LINGO-1的拮抗性相關(guān)性實驗研究以及探究LINGO-1在神經(jīng)再生中的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。但是鑒于神經(jīng)軸突再生微環(huán)境的極其復(fù)雜，受多重因素的影響；通過RNAi來降低人源細胞LINGO-1的表達，能否促進神經(jīng)軸突的再生以及對LINGO-1相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否產(chǎn)生影響，均需要進一步探究。

作者貢獻：楊印祥、欒佐進行實驗設(shè)計；索磊進行實驗實施、評估、資料收集以及論文撰寫；欒佐進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Construction and Identification of Lentiviral Interference Vector That Including Human LINGO-1

SUOLei,YANGYin-xiang,LUANZuo.

TheThirdClinicalCollegeofMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

LUANZuo，theThirdClinicalCollegeofMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515；DepartmentofPediatrics，NAVYGeneralHospital,Beijing100048,China；E-mail:luanzuo2009@163.com

ObjectiveTo construct the lentiviral interference vector that including human LINGO-1 in vitro and evaluate its interference effects on the target gene LINGO-1.MethodsFrom March to November in 2015,interference sequences that targeted at human LINGO-1 interfered by short hairpin RNA (LINGO-1 shRNA) were designed and synthesized according to the LINGO-1 gene sequence reported in GenBank database,LINGO-1 shRNA was cloned into recombinant plasmid vectors.They were assembled in 293T cells after sequence verification.The test divided into interference vector group of target gene (experimental group) and interference vector group of mismatch sequence (control group),the lentiviral vectors were transfected into U251 cells of human glioma,and its efficiency of infection was observed by fluorescence microscopy.Immunofluorescent staining and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method were adopted to detect the expression level of LINGO-1 mRNA.The expression level of LINGO-1 was detected by Western blotting method.ResultsTwo groups of lentiviral interference vectors were successfully constructed,and the virus stock solutions with a titer of 2×108TU/ml and 4×108TU/ml were obtained respectively after package.After U251 cells of human glioma were transfected with virus vectors,the transfection efficiency of vectors in experimental group and control group were 96.6% and 95.2% respectively.Immunofluorescent staining presented that LINGO-1 was highly expressed in U251 cells of human glioma,and immunofluorescence in experimental group weakened after the transfection of lentiviral vectors.The expression level of LINGO-1 mRNA in experimental group (0.09±0.01) was significantly decreased compared with that in control group (1.00±0.00) (t=12.87，P<0.01),and the interference rate of LINGO-1 mRNA relative expression in experimental group was 91.0%.Compared with control group (1.00±0.00),the LINGO-1 expression level of experimental group (0.28±0.02) was significantly decreased (t=-8.13,P<0.01).ConclusionThe paper has successfully constructed lentiviral shRNA interference vectors that targeting at human LINGO-1,and verified there are good inference effects of interference vectors on target genes,which provides basis for studying the role of LINGO-1 in axon regeneration.

Lentivirus；RNA interference；LINGO-1

國家自然科學(xué)基金面上項目(81471486)

510515廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(索磊，欒佐)；中國人民解放軍海軍總醫(yī)院兒科(楊印祥，欒佐)

欒佐,510515廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，中國人民解放軍海軍總醫(yī)院兒科；

E-mail:luanzuo2009@163.com

R 349.65

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.019

2016-01-02；

2016-06-25)