劉海燕，張建偉（.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063000；.唐山師范學(xué)院體育系，河北唐山063000）

明日葉對過度訓(xùn)練致大鼠胃腸功能紊亂影響的研究

劉海燕1，張建偉2
（1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063000；2.唐山師范學(xué)院體育系，河北唐山063000）

研究明日葉對過度訓(xùn)練致大鼠胃腸功能紊亂的作用。建立雄性大鼠過度訓(xùn)練模型，觀察過度訓(xùn)練組、補(bǔ)充明日葉組的大鼠腸道主要菌群雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量，腸道代謝產(chǎn)物脲酶、β-半乳糖苷酶活性和主要SCFA含量，以及血漿內(nèi)毒素、組織勻漿SIgA含量的變化。與正常對照組比較，過度訓(xùn)練組雙歧桿菌數(shù)量及B/E比值顯著升高，大腸桿菌數(shù)量顯著降低；β-半乳糖苷酶活性及主要SCFA乙酸、丁酸含量顯著降低，脲酶活性顯著升高；組織勻漿SIgA含量顯著下降，而血漿內(nèi)毒素含量顯著升高。補(bǔ)充明日葉組各指標(biāo)與對照組比較均無顯著差異。結(jié)果表明，明日葉能夠從腸道菌群、腸道代謝產(chǎn)物及腸道屏障等幾個方面對腸道微生態(tài)進(jìn)行綜合調(diào)理，促進(jìn)腸道健康。

明日葉；過度訓(xùn)練；運(yùn)動型胃腸綜合癥；腸道微生態(tài)

明日葉為多年生草本，芹科植物，原產(chǎn)地為日本八丈島。從日本的江戶時代開始，當(dāng)?shù)鼐用窬陀忻魅杖~的食用歷史，并認(rèn)識到了它的藥用價(jià)值。近年來，研究發(fā)現(xiàn)明日葉里富含多種有益成分，包括11種維生素、13種礦物質(zhì)、葉綠素、酶、胡蘿卜素、鍺、皂角苷、蛋白質(zhì)、植物纖維、醣苷、香豆素，還有一類十分罕見的化合物查爾酮[1]。最新研究表明，明日葉有很多有利于健康的功效，如能促進(jìn)免疫系統(tǒng)功能，改善胃腸道健康，治療肩膀疼痛等肌肉方面疾病，緩解長期疲勞及各種慢性疾病等。明日葉集抗氧化、抗感染、抗微生物、抗腫瘤等功效于一身，可以說是一種超級食品[2]。

在大強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練及比賽中，運(yùn)動員經(jīng)常會出現(xiàn)腹瀉、腹痛、嘔吐、惡心、吐酸水等胃腸癥狀，運(yùn)動醫(yī)學(xué)中將這種運(yùn)動員在運(yùn)動中及運(yùn)動后引起的各種胃腸道癥狀，總稱為運(yùn)動性胃腸綜合征[3]。在運(yùn)動中，尤其是一些力竭性的耐力運(yùn)動項(xiàng)目中，胃腸綜合征的發(fā)生率更高為20%～50%[4]。其影響因素有：運(yùn)動形式、持續(xù)時間、運(yùn)動強(qiáng)度、年齡、性別、訓(xùn)練狀態(tài)、飲食情況等[4]。其中運(yùn)動強(qiáng)度是引起胃腸綜合征的主要因素。在探究該病癥的形成原因時，過去人們一直把目光集中在運(yùn)動員是否吃了不干凈的食物。而近來，研究人員發(fā)現(xiàn)大強(qiáng)度的運(yùn)動使運(yùn)動員腸道微生態(tài)發(fā)生變化。胃腸道微生態(tài)失調(diào)是引發(fā)運(yùn)動性胃腸綜合征的一種綜合病因[5]。

運(yùn)動員要提高訓(xùn)練水平，保證在比賽中創(chuàng)造優(yōu)良的成績，需要具備的先決條件就是強(qiáng)健的體魄，能承受大負(fù)荷的訓(xùn)練。因此，健康運(yùn)動員腸道微生態(tài)是不能忽視的環(huán)節(jié)，而且，對于運(yùn)動性胃腸綜合征的治療原則，必須采取綜合措施，把重點(diǎn)放在恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡上，通過改善腸道微生態(tài)達(dá)到預(yù)防和治療運(yùn)動性胃腸綜合癥的目的[6-8]，在保障運(yùn)動員身體健康的前提下提高運(yùn)動能力[4]。

明日葉有極強(qiáng)的改善胃腸健康的作用，但是很少見到將其用于運(yùn)動性胃腸綜合癥的科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。為此，我們探討利用天然植物明日葉來調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，減少運(yùn)動性胃腸綜合征的發(fā)生，為其廣泛應(yīng)用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮明日葉：山東明日葉莊園；蛋白胨、BBL瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基、異丙醇、醋酸鈉、無水乙醇、冰乙酸、丙酸、丁酸、α-甲基戊酸、磷酸等分析純：北京化學(xué)試劑公司；對-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷、血清睪酮、血清皮質(zhì)酮測定試劑盒：Sigma公司；顯色基質(zhì)鱟試劑盒：廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；組織勻漿ELISA試劑盒（SIgA）：美國R&D公司。

1.2儀器與設(shè)備

DL-CJ超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器公司；BS-2F恒溫?fù)u床：常州冠華儀器制造有限公司；5427R高速離心機(jī)：Ependorff公司；970CR熒光分光光度計(jì)：上海分析儀器廠；UVIKON XL-172紫外-可見光分光光度計(jì)：法國SECOMAM公司；GC-2014 SHIMADZU全套氣相色譜儀：日本島津。

1.3方法

1.3.1模型制備、分組及運(yùn)動訓(xùn)練方案

雄性SD大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司），6周齡，體重（180±18.8）g。普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組、過度訓(xùn)練組和明日葉組，每組10只大鼠。依據(jù)顧明建立的大鼠跑臺過度訓(xùn)練模型建立本研究的模型[9]。

對照組：不進(jìn)行任何訓(xùn)練，每天補(bǔ)充同劑量的生理鹽水。

過度訓(xùn)練組：進(jìn)行持續(xù)性大運(yùn)動量跑臺訓(xùn)練10周，跑臺坡度為1°。第1周每天適應(yīng)性訓(xùn)練10 m/min× 30 min。第2至10周為正式訓(xùn)練，周日休息，每次從15m/min開始，每5min速度增加5 m/min，直至40 m/min，保持此強(qiáng)度至力竭，并記錄每只大鼠運(yùn)動到力竭的總時間，計(jì)算平均值。在訓(xùn)練過程中動態(tài)觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食、睡眠等情況。力竭標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)大鼠不能維持跑臺的預(yù)定速度，隨轉(zhuǎn)動皮帶拖至跑臺后端的擋板處停留達(dá)30 s以上，毛刷驅(qū)趕或手輕推均無效，視為力竭[10]。

明日葉組：訓(xùn)練方法同過度訓(xùn)練組，訓(xùn)練時間為過度訓(xùn)練組的平均值。在每次訓(xùn)練前3、1 h分別灌服用生理鹽水等體積新鮮配制的明日葉鮮榨汁溶液，補(bǔ)充劑量為3 mL/kg體重。

1.3.2樣品制備

動物末次運(yùn)動訓(xùn)練后，取大鼠新鮮糞便；之后，禁食12 h，取大鼠尾部血液，2 mL血液于帶有肝素抗凝管的無菌密閉試管，分離得血漿，另4 mL血液離心分離得血清，備用；取血后，脫頸處死取大鼠回腸，迅速用錫紙包裹投入液氮冷凍，-80℃保存，備用。

1.3.3指標(biāo)測定

腸道微生物測定：平板培養(yǎng)雙歧桿菌、大腸桿菌，并計(jì)算B/E（雙歧桿菌/大腸桿菌）比值。各組分別取每只大鼠的新鮮糞便樣品0.5 g，于裝有玻璃珠和50 mL 0.1%蛋白胨稀釋液的滅菌三角瓶內(nèi)，劇烈震蕩直至糞便樣品混勻。將糞便樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別放入滅菌的裝有9 mL 0.1%蛋白胨稀釋液的厭氧管內(nèi)。取適當(dāng)稀釋的糞便樣品各50μL分別加入倒好的BBL瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂固體平板培養(yǎng)基中，均勻涂布，培養(yǎng)24 h，分別進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算B/E比值。

腸道代謝產(chǎn)物測定：β-半乳糖苷酶，脲酶，SCFA（短鏈脂肪酸）。取大鼠糞便0.2 g，于2 mL無菌ddH2O水中，震蕩混勻，室溫過夜。而后，劇烈震蕩至完全分散成勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清進(jìn)行酶活測定及SCFA測定。脲酶活性測定按照Malin的方法[11]，β-半乳糖苷酶活性測定按照Yamany的方法[12]。

糞便SCFA含量測定：用色譜法測定[13]。

血漿內(nèi)毒素測定：血液樣品制備、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、鱟試劑、顯色基質(zhì)及偶氮化試劑等的溶解按照試劑盒步驟進(jìn)行。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制見表1，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

SIgA測定：取回腸樣品稱重100 mg，移入勻漿管中；取預(yù)冷的生理鹽水于勻漿管中，生理鹽水的體積為組織塊重量的9倍；充分研碎，組織勻漿化得10%勻漿；將制備好的10%勻漿于4℃下4 000 r/min離心20 min；取適量上清液，按照SIgA測定的ELISA試劑盒測定SIgA含量。

表1　內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制Table 1　Preparation of endotoxin standard solution

圖1　內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of endotoxin

血清睪酮、血清皮質(zhì)酮測定：血清睪酮含量采用放射免疫法測定。血清皮質(zhì)酮含量采用ELISA測定。以上都嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，并計(jì)算血清睪酮/血清皮質(zhì)酮（T/C）比值。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行分析，Student’s t檢驗(yàn)。P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1實(shí)驗(yàn)大鼠一般表現(xiàn)

在整個實(shí)驗(yàn)過程中，對照組大鼠體毛有光澤，較為活潑。過度訓(xùn)練組大鼠毛發(fā)稀疏且蓬亂無光澤，精神委靡，嗜睡。第五周時，補(bǔ)充明日葉組大鼠體毛比較潔凈，精神狀態(tài)較好，活潑。明日葉組大鼠的表現(xiàn)較過度訓(xùn)練組大鼠明顯改善，說明明日葉可以起到改善過度疲勞的作用。

2.2糞便微生物的變化

腸道菌群是機(jī)體的“第二指紋”，菌群的變化直接反映機(jī)體的健康狀況[14]。其中，雙歧桿菌是腸道中普遍存在的對健康有重要作用的菌群。大腸桿菌作為條件致病菌，在機(jī)體抵抗力下降時含量增多，被認(rèn)為是評價(jià)腸道菌群狀態(tài)的一個重要指標(biāo)[15]。在很多與腸道相關(guān)疾病的研究中，通常將雙歧桿菌、大腸桿菌及雙歧桿菌與大腸桿菌數(shù)量的比值，即B/E比值作為重要指標(biāo)進(jìn)行測定[16]。

糞便微生物變化見表2。

表2　糞便微生物變化Table 2　The changes of fecalflora

如表2所示，與對照組比較，過度訓(xùn)練組的雙歧桿菌數(shù)量顯著降低，大腸桿菌數(shù)量顯著升高，B/E比值顯著降低（P<0.05），說明腸道主要菌群數(shù)量失衡；而明日葉組與對照組相比雙歧桿菌數(shù)量、大腸桿菌數(shù)量以及B/E比值沒有明顯變化，與過度訓(xùn)練組比較，明日葉組雙歧桿菌數(shù)量和B/E比值顯著升高（P<0.05），大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P<0.05），說明明日葉有改善腸道菌群的作用。

2.3糞便酶活變化

腸道菌群所產(chǎn)酶活性高低直接反映腸道健康[17-18]，這一研究成果早已被人們所認(rèn)同。其中，β-半乳糖苷酶對腸道健康有重要促進(jìn)作用，酶活性過低會阻礙碳水化合物的吸收代謝，引起腸道潰瘍性疾病[4，19]。尿素是哺乳動物產(chǎn)生的主要的含氮廢物。脲酶能催化尿素水解為無機(jī)氨和二氧化碳。脲酶和無機(jī)氨過多會造成腸腔中致病菌增多，損壞黏膜組織[19]。腸道菌群的變化必然引起酶活性的變化。

各組大鼠糞便酶活變化見圖2。

由圖2可知，與對照組相比，過度訓(xùn)練組大鼠糞便β-半乳糖苷酶活性顯著降低（P<0.01），脲酶活性顯著升高（P<0.05），說明腸道黏膜很可能受損；明日葉組兩種酶活性與對照組比較沒有顯著差異，而與過度訓(xùn)練組比較β-半乳糖苷酶活性顯著升高（P<0.05），脲酶活性顯著降低（P<0.05），結(jié)合表2的結(jié)果，說明明日葉的補(bǔ)充使腸道雙歧桿菌數(shù)量增加，腸道有益菌的增加又提高了β-半乳糖苷酶的活性，降低了脲酶活性，從而保護(hù)了腸道黏膜。本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了前人有關(guān)腸道菌群與酶活關(guān)系的研究。

2.4糞便SCFA變化

機(jī)體內(nèi)腸道優(yōu)勢菌群是厭氧菌，包括雙歧桿菌、乳酸菌等。這些厭氧菌在適宜底物存在時能發(fā)酵底物產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA），其中的乙酸、丙酸和丁酸含量最高，是腸道中主要的SCFA[20]。SCFA對腸道健康的促進(jìn)作用有降低糞便pH值，減少糞便的細(xì)胞毒作用，增加膽酸經(jīng)糞便排泄，減少直腸細(xì)胞增生，預(yù)防結(jié)腸癌等。

圖2　各組大鼠糞便酶活變化Fig.2　The changes of fecalenzyme activities ofrats

糞便短鏈脂肪酸變化見表3。

表3　糞便短鏈脂肪酸變化Table 3　The changes of fecal SCFAs

表3顯示，與對照組比較，過度訓(xùn)練組大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量顯著降低（P<0.05），推測正是因?yàn)檫^度訓(xùn)練組的腸道有益菌數(shù)量減少所致；明日葉組大鼠乙酸、丁酸含量與對照組相比沒有顯著差異，而與過度訓(xùn)練組比較，明日葉組的乙酸、丙酸、丁酸含量都顯著增加（P<0.05），結(jié)合表2的結(jié)果，提示明日葉的補(bǔ)充通過增加腸道中雙歧桿菌、提高B/E比值而增加了SCFA的含量，進(jìn)而促進(jìn)了腸道健康。

2.5SIgA及血漿內(nèi)毒素含量變化（μmol/g）

人和動物體內(nèi)都存在著粘膜免疫系統(tǒng)，是機(jī)體抗感染的第一道防線。粘膜表面與外界抗原直接接觸，SIgA位于腸粘膜表面粘液中[21]。SIgA缺陷或者不足可改變小腸絨毛及腸壁結(jié)構(gòu)，引起吸收不良等癥狀。腹瀉等腸道疾病患者SIgA含量通常低。內(nèi)毒素主要成份是脂多糖（LPS），細(xì)菌在生活狀態(tài)不釋放內(nèi)毒素，只有當(dāng)細(xì)菌死亡引起自溶或粘附在其他細(xì)胞時才表現(xiàn)出毒性。當(dāng)腸道屏障受損時，即使是黏膜通透性發(fā)生輕微增加，LPS也可通過腸黏膜屏障，導(dǎo)致血漿內(nèi)毒素升高，甚至形成內(nèi)毒素血癥[22]。所以通常將SIgA和血漿內(nèi)毒素作為腸道屏障功能的重要評價(jià)指標(biāo)。

各組大鼠SIgA含量見圖3。

圖3　各組大鼠SIgA含量Fig.3　Concentration of SIgA

由圖3可知，與對照組比較，過度訓(xùn)練組大鼠組織勻漿SIgA含量顯著降低（P<0.05）；明日葉組大鼠組織勻漿SIgA含量與對照組比較沒有顯著差異，而與過度訓(xùn)練組比較，明日葉組大鼠組織勻漿SIgA含量顯著升高（P<0.05）。血漿內(nèi)毒素濃度變化見表4。

表4　血漿內(nèi)毒素濃度變化Table 4　Levelof plasma endotoxins

由表4可知，與對照組比較，過度訓(xùn)練組大鼠血漿內(nèi)毒素含量顯著升高（P<0.05）；明日葉組大鼠血漿內(nèi)毒素與對照組比較含量沒有顯著變化，而與過度訓(xùn)練組比較，明日葉組大鼠血漿內(nèi)毒素含量顯著降低（P< 0.05）。以上結(jié)果說明補(bǔ)充明日葉可以通過增加SIgA的含量改善了腸道粘膜屏障功能，減少內(nèi)毒素透過腸道屏障。

2.6血清睪酮及血清皮質(zhì)酮變化

目前對于過度訓(xùn)練的診斷還沒有統(tǒng)一的單項(xiàng)指標(biāo)，一般采用多指標(biāo)綜合判斷。因此，本研究也采用多指標(biāo)綜合診斷的方法。血清睪酮、血清皮質(zhì)酮是判斷過度訓(xùn)練模型成功建立與否的重要指標(biāo)[23-24]。

血清睪酮、血清皮質(zhì)酮濃度變化見表5。

表5　血清睪酮、血清皮質(zhì)酮濃度變化Table 5　Levelof tserum corticosterone，estosterone and the ratio of T/C

表5顯示，與對照組相比，過度訓(xùn)練組血清皮質(zhì)酮含量顯著升高（P<0.05），血清睪酮含量及T/C比值都顯著下降（P<0.05），結(jié)合過度訓(xùn)練組大鼠的表現(xiàn)，如明顯的食欲不振、睡眠障礙、不能維持跑臺的預(yù)定速度、隨轉(zhuǎn)動皮帶拖至跑臺后端的擋板處停留達(dá)30 s以上，而且毛刷驅(qū)趕或手輕推均無效，說明大鼠過度訓(xùn)練模型的建立是成功的；明日葉組大鼠各指標(biāo)沒有顯著變化，而與過度訓(xùn)練組比較，明日葉組大鼠血清皮質(zhì)酮含量顯著降低（P<0.05），血清睪酮含量及T/C比值顯著升高（P<0.05），說明明日葉的補(bǔ)充降低了大鼠的疲勞程度，與各組大鼠的一般表現(xiàn)相一致。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，明日葉能夠顯著增加大鼠腸道有益菌，減少有害菌，改善糞便酶活，增加糞便短鏈脂肪酸的含量，增加SIgA含量并降低血漿內(nèi)毒素含量，從而達(dá)到對腸道菌群、腸道代謝產(chǎn)物及腸道屏障等腸道微生態(tài)的綜合調(diào)理，以起到改善運(yùn)動性胃腸綜合癥的作用。

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Study of the Effect of Ashitaba on Gastrointestinal Disorders Induced by Overtraining Rat

LIU Hai-yan1，ZHANG Jian-wei2
（1.SchoolofPublic Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，Hebei，China；2.Departmentof PhysicalEducation，Tangshan Normal University，Tangshan 063000，Hebei，China）

The effect of Ashitaba on gastrointestinal disorders induced by overtraining rat was studied.Male overtraining rats were used as research rats.For exercise，overtraining and Ashitaba supplement，the changes in the numbers of Bifidobacterium and E.coli，the activity ofβ-galactosidase and urease，the content of SCFA，SIgA and plasma endotoxin were measured.Compared with normal control group，in overtraining group，the number of Bifidobacterium and the ratio of B/E were significantincreased，the number of E.coli was decreased. The activity ofβ-galactosidase and the levels of acetic acid and butyric acid were remarkably lower in overtraining group，in contrast，the activity of urease was higher.The content of SIgA of overtraining groupwas notably falling，on the contrary，the level ofplasma endotoxin was rising.For the study，ashitaba has a good ability to improve intestinal microecology，such as intestinal flora，intestinal metabolites and intestinal barrier，to promote guthealth with a comprehensive and integrated effect.

Ashitaba；overtraining；sports gastrointestinalsyndrome；intestinalmicroecology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.040

河北省教育廳項(xiàng)目（ZD2015122）；唐山市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（14130254B）；2014省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410081087）

劉海燕（1977—），女（漢），講師，博士，研究方向：功能性食品的開發(fā)利用。

2015-10-09