黃島平，江思華，林葵，*，陳建紅，蘇梅清，黃祖林，黃文琦，黎穎（.廣西分析測(cè)試研究中心，廣西南寧5300；.廣西師范學(xué)院，廣西南寧53000）

HPLC法同時(shí)測(cè)定紅棗及其制品中3種防腐劑

黃島平1，江思華2，林葵1，*，陳建紅1，蘇梅清1，黃祖林1，黃文琦1，黎穎1
（1.廣西分析測(cè)試研究中心，廣西南寧530022；2.廣西師范學(xué)院，廣西南寧530001）

為探查紅棗中未知有害添加物，采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定紅棗及其制品中山梨酸、苯甲酸和脫氫乙酸含量。結(jié)果表明：濃度在12.5μg/mL～100μg/mL范圍內(nèi)，苯甲酸、山梨酸與脫氫乙酸成良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=3×106x-53 924，r=0.999 9；y=6×106x-114 017，r=0.999 9；y=3×106x-84 592，r=0.999 9；最低檢測(cè)限分別為0.36、0.38、0.56 mg/kg；平均回收率分別為101.4%、100.6%、100.2%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，43批不同產(chǎn)地不同品種紅棗及其制品中，脫氫乙酸未檢出；1批紅棗制品檢出山梨酸（0.072 8 g/kg）；23批紅棗檢出苯甲酸（0.009 5 g/kg～0.118 0g/kg），并經(jīng)質(zhì)譜定性確證。

高效液相色譜法；紅棗；紅棗制品；山梨酸；苯甲酸；脫氫乙酸

紅棗在我國已有4 000多年栽培歷史了，主要分布河南、河北、山西、陜西、山東、新疆等地，有“天然維生素丸”的美譽(yù)，營養(yǎng)價(jià)值高，又具有一定的藥用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。我國棗資源豐富，據(jù)報(bào)道有棗品種736個(gè)，制干或鮮食制干品種占30.4%，共有224個(gè)[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，消費(fèi)者對(duì)食品的安全性日益關(guān)注。為防止食品腐敗變質(zhì)，保持食品的鮮度，化學(xué)添加劑廣泛用于各種食品和飲料。苯甲酸由于其低成本，常常被不法廠商濫用于食品和藥品中。食入過量的化學(xué)添加劑具有潛在的毒害，對(duì)人體的毒性主要有致畸性、致癌性和致突變性[2]。為了研究紅棗中未知添加物，2013年承擔(dān)廣西科技廳項(xiàng)目并開始調(diào)查，2014年采樣檢測(cè)其中苯甲酸完成論文初稿后，發(fā)現(xiàn)孫屏[2]等對(duì)新疆紅棗中苯甲酸含量進(jìn)行了調(diào)查研究，在新疆紅棗中檢出苯甲酸，并走訪產(chǎn)業(yè)鏈，證實(shí)為天然苯甲酸，含量最高為153 mg/kg，在95%置信水平下駿棗中苯甲酸含量處于74 mg/kg～95 mg/kg；丁春瑞等用毛細(xì)管氣相法測(cè)定了其中甜蜜素[4]。檢測(cè)方法中，國家標(biāo)準(zhǔn)有3個(gè)[5-7]，學(xué)術(shù)論文中羅成玉對(duì)果凍中苯甲酸等5種成分進(jìn)行了檢測(cè)研究[8]。不法商販為了利益最大化，也有可能懷著僥幸心理，違法添加防腐劑以使產(chǎn)品存放時(shí)間延長。為此，本文檢測(cè)了新疆紅棗，本地市場(chǎng)鮮棗、及紅棗制品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸含量，除對(duì)苯甲酸進(jìn)行質(zhì)譜定性外，還建立了3種防腐劑同時(shí)檢測(cè)的液相色譜方法。

1　材料與方法

1.1儀器、試劑和樣品

Waters ALLIANCE 2695高效液相色譜系統(tǒng)，配Waters2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站、Waters XEVO G2-S QTOF/MS四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國沃特世公司；T25基本分散器：德國IKA公司；CGR22G超高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；AB204電子天平：瑞士梅特勒公司；HR2864，325W粉碎機(jī)：飛利浦公司；KQ5200超聲波清洗器：昆山市超聲儀器公司。

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸：均購買于中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇：色譜純，默克公司、乙酸銨：分析純，成都市科龍化工試劑廠；亞鐵氰化鉀、冰乙酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸鋅：分析純，廣東光華科技股份有限公司；超純水：北京愛思泰克科技開發(fā)有限責(zé)任公司逆滲透純水機(jī)制備。

乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水至1 000 mL溶解，經(jīng)0.45μm水膜過濾。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取106 g亞鐵氰化鉀[K4Fe （CN）6·3H2O]溶液加水至1 000 mL。

乙酸鋅：稱取220 g乙酸鋅[Zn（CH3COO）2·2H2O]，溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀釋至1 000 mL。

樣品來源：紅棗及其制品采購于南寧市南城百貨、沃爾瑪超市、華聯(lián)超市；鮮棗采購于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液及其配制

1.2.1.1苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mg/mL

準(zhǔn)確稱取苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.236 0 g，加水溶解并定容至200 mL，此溶液每毫升含苯甲酸1.00 mg。

1.2.1.2山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mg/mL

準(zhǔn)確稱取山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品0.268 0 g，加水溶解并定容至200 mL，此溶液每毫升含山梨酸1.00 mg。

1.2.1.3脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mg/mL

準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，用10 mL 20 g/L的氫氧化鈉溶液溶解，用水定容至100 mL。

1.2.1.4混合標(biāo)準(zhǔn)使用液

分別吸取不同體積苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0.000、0.010、0.020、0.040、0.050、0.080 mg/mL。

1.2.2供試品溶液的制備

稱取2 g粉碎后的紅棗樣品，于50 mL的比色管中，加入20 mL水，超聲震蕩提取10 min，并于旋渦混合器上劇烈混合2 min，分別加入2 mL的亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液，搖勻，最后用水定容至刻度。移入離心管，于10 000 r/min離心10 min，吸出上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾上機(jī)待定。

1.2.3色譜條件

色譜柱為AtlantisRT3柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為乙酸銨溶液（0.02 mol/L），梯度洗脫程序見表1。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1　Mobile phase gradient elution program

流速1 mL/min；柱溫25℃；變波長測(cè)定：0～20 min，230 nm；20 min～30 min，293 nm，進(jìn)樣量為10μL。1.2.4液質(zhì)條件

液相條件：色譜柱：Waters Acquity BEHC18，1.7μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液∶乙腈=95∶5（體積比）；流速0.4 mL/min；運(yùn)行時(shí)間：5 min；吸收波長：230 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：1.00μL。

質(zhì)譜條件：離子源：大氣壓電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子檢測(cè)模式；毛細(xì)管壓力：2.7 kV；源溫度：100℃，源補(bǔ)償：80 V；錐孔氣流：30 L/h；溶劑溫度：300℃；溶劑氣流：800 L/h；碰撞能量：6 V；檢測(cè)能量：2 575 V；掃描范圍：100 m/z～400 m/z。

2　結(jié)果與討論

2.1苯甲酸的定性與定量

在“1.2.3”規(guī)定的色譜條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

圖1　混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1　The chromatography ofmixed standard solution

濃度為0.05 mg/mL。樣品編號(hào)按采用時(shí)間先后順序進(jìn)行編號(hào)。樣品信息見表2。

表2　樣品信息Table 2　The information ofsamples

圖2為樣品L-06的色譜圖。

圖2　樣品L-06的色譜圖Fig.2　The chromatography of sample L-06

同時(shí)取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品與供試品L-06與L-28，進(jìn)行液質(zhì)對(duì)照分析（條件見1.2.4），發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品與供試品在相對(duì)分子質(zhì)量MS=121.029有明顯的苯甲酸特征質(zhì)譜信號(hào)峰，見圖3、圖4、圖5，證實(shí)了紅棗樣品中確實(shí)存在苯甲酸。

2.2線性關(guān)系

以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，計(jì)算得出苯甲酸，山梨酸，脫氫乙酸的線性方程分別為y=3× 106x-53 924，r=0.999 9；y=6×106x-114 017，r=0.999 9；y=3×106x-84 592，r=0.9999；。最低檢測(cè)限分別為0.36、0.38、0.56 mg/kg。結(jié)果表明，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸在12.5μg/mL～100μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系。

2.3精密度試驗(yàn)

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（50μg/mL）10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得苯甲酸、山梨酸與脫氫乙酸的RSD分別為0.48%，0.65%，0.16%，表現(xiàn)精密度良好。2.4回收率與重復(fù)性試驗(yàn)

圖3　苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖譜Fig.3　The MS spectra ofbenzoic acid standard solution

圖4　L-06樣品的質(zhì)譜圖Fig.4　The MS spectra ofsample L-06

圖5　L-28樣品的質(zhì)譜圖Fig.5　The MS spectra ofsample L-28

稱取已知含量的L-06樣品6份，加入一定量苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行操作，測(cè)定含量，計(jì)算回收率與重復(fù)性，結(jié)果分別見表3、表4、表5。

表3　苯甲酸回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3　The result ofrecovery for benzoic acid

經(jīng)計(jì)算苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的平均回收率分別為：101.4%、100.6%、100.2%，RSD分別為0.73%、0.82%、0.69%。結(jié)果表明該方法的回收率與重復(fù)性較好。

表4　山梨酸回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4　The result ofrecovery for sorbic acid

表5　脫氫乙酸回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5　The result ofrecovery for dehydroacetic acid

2.6樣品的測(cè)定

按上述處理方法和色譜條件，檢測(cè)不同批次紅棗、本地市場(chǎng)鮮棗（干燥）及紅棗制品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的含量，測(cè)試結(jié)果如表6、表7、表8所示。

表6　紅棗中檢測(cè)結(jié)果Table 6　The detection resultofjujube

表7　本地鮮棗干燥后測(cè)試結(jié)果Table 7　The detection resultoflocalfresh jujube after being dried

3　結(jié)論

1）本試驗(yàn)采用高壓液相色譜法同時(shí)測(cè)定紅棗及其制品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸含量，精密度好，回收率高，方法檢出限等滿足實(shí)際工作需要。

2）從表6、表7、表8的測(cè)試結(jié)果看出，43個(gè)樣中，均未檢出脫氫乙酸，檢出率為0；其中有23個(gè)檢測(cè)出苯甲酸（0.009 5 g/kg～0.118 0 g/kg），苯甲酸檢出率53%；1個(gè)樣品檢出山梨酸，檢出率為2.3%。

22個(gè)紅棗樣品，主要產(chǎn)地為新疆，其他產(chǎn)地為河南、山東、陜西各一個(gè)，山梨酸、脫氫乙酸均未檢出，而20個(gè)紅棗中檢出苯甲酸，含量為0.009 5 g/kg～0.118 g/kg （0.059 9±0.032 2）g/kg，檢出率91%。質(zhì)譜定性確證為苯甲酸。為了證實(shí)紅棗中檢出的苯甲酸是其本身帶有或人為添加，在本地南寧市采集了10個(gè)鮮棗樣品（來自新疆等地），烘干后檢測(cè)了其中3種防腐劑含量，均未檢出。按常規(guī)來判斷，防腐劑中含量小于0.1 g/kg時(shí)，一般可考慮為天然含有或加工中隨原輔料（或加工助劑）帶入。紅棗為未加工，初步判定為本身帶有，與文獻(xiàn)[3]結(jié)論吻合。只有2個(gè)紅棗樣品苯甲酸含量超過0.1 g/kg的3%～18%，占檢出產(chǎn)品中的10%，或?yàn)闄z出誤差，或存在少量的安全隱患。新疆、山東、河南、陜西紅棗大部分含苯甲酸，少部分不含，說明不同地域、不同品種有差異；而在本地購買的鮮棗沒有檢出苯甲酸，可能因其運(yùn)輸鏈長，成熟度不夠即采摘裝箱，還未來得及產(chǎn)生苯甲酸。

表8　紅棗制品中測(cè)試結(jié)果Table 8　The detection resultofjujube products

本項(xiàng)目同時(shí)測(cè)定了11個(gè)紅棗制品中3種防腐劑含量，其中3個(gè)檢出苯甲酸，范圍在0.010 5 g/kg～ 0.080 3 g/kg，1個(gè)檢出山梨酸（0.072 8 g/kg），脫氫乙酸未檢出。根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[8]中蜜餞涼果類規(guī)定，苯甲酸、山梨酸允許添加量均為0.5 g/kg，脫氫乙酸不能添加。所檢測(cè)的紅棗制品中3種防腐劑含量均符合要求。

本次檢測(cè)調(diào)查說明，紅棗及其制品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸違法添加風(fēng)險(xiǎn)不大。

[1]梁洪.中國紅棗及紅棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀、存在問題和對(duì)策的研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2006

[2]王晶.食品安全快速檢測(cè)技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001:9-12

[3]孫屏,呂岳文,劉超,等.新疆紅棗中天然苯甲酸含量的調(diào)查研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,51(2):235-240

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì).GB/T 5009. 29-2003食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì).GB/T 5009. 121-2003食品中脫氫乙酸的測(cè)定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì).GB/T 23495-2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009

[7]羅成玉.果凍中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸同時(shí)測(cè)定方法[J].上海計(jì)量測(cè)試,2013,233(1):18-20

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì),GB 2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014

Simultaneous Determination of Three Preservatives in Jujube and Its Products by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Dao-ping1，JIANG Si-hua2，LIN Kui1，*，CHEN Jian-hong1，SU Mei-qing1，HUANG Zu-lin1，HUANG Wen-qi1，LIYing1
（1.GuangxiResearch Centre ofAnalysis，Nanning 530022，Guangxi，China；2.GuangxiTeacher's College，Nanning 530001，Guangxi，China）

To find the unknown injurious additives in jujube，High Performance Liquid Chromatography （HPLC）was used to determine benzoic acid，sorbic acid and dehydroacetic acid in jujube.The results showed that benzoic acid，sorbic acid and dehydroacetic acid had good linear relations when the concentration was in the range of12.5μg/mL-100μg/mL.Standard curves were y=3×106x-53 924，r=0.999 9；y=6×106x-114 017，r=0.999 9；y=3×106x-84 592，r=0.9999.The average recoveries of benzoic acid，sorbic acid and dehydroacetic acid were 101.4%，100.6%，100.2%.Their lowestlimits ofdetection were 0.36，0.38，0.56 mg/kg.In addition，Dehydroacetic acid had not been detected among 43 kinds ofdifferent habitats and species of jujube and its related products.Sorbic acid had been detected in one sample（0.072 8 g/kg）.And benzoic acid had been detected in 23 samples（0.009 5 g/kg-0.0118 0 g/kg）.Above detections had proved by Mass Spectrometer.

HPLC；jujube；jujube products；benzoic acid；sorbic acid；dehydroacetic acid

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.030

廣西六類主要食品中安全質(zhì)量分析及違法添加物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的研究（桂科攻1355010）；防腐劑、真菌毒素及污染物的固相萃取快速檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用（桂科能14123006-20）

黃島平（1965—），男（漢），高級(jí)工程師，學(xué)士，研究方向：食品檢測(cè)及方法研究。

林葵，高級(jí)工程師，學(xué)士，研究方向：食品營養(yǎng)成分、檢測(cè)及方法研究。

2015-05-24