周建國(guó) 鄔蘭 馬雙姣 石林春 金鉞 姚輝

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基于ITS2序列的荊芥及其混偽品的DNA條形碼鑒定

周建國(guó) 鄔蘭 馬雙姣 石林春 金鉞 姚輝

目的 通過分析裂葉荊芥及其混偽品的ITS2條形碼序列，探索鑒定荊芥、荊芥穗及其混偽品的新方法，以保證荊芥的質(zhì)量及臨床療效。方法 對(duì)裂葉荊芥樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增ITS2片段和雙向測(cè)序，所有序列用軟件MEGA 6.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，對(duì)裂葉荊芥及其混偽品間的種間序列差異進(jìn)行分析比較，計(jì)算其種間、種內(nèi)K2P遺傳距離，并構(gòu)建鄰接樹。結(jié)果 裂葉荊芥ITS2序列長(zhǎng)度為232 bp，G+C含量為66.8%，序列高度保守，種內(nèi)無變異位點(diǎn)。裂葉荊芥與其混偽品種間變異位點(diǎn)較多，種間K2P最小距離為0.0175，大于其種內(nèi)距離，NJ樹顯示可以將裂葉荊芥與其混偽品完全分開。結(jié)論 ITS2序列可鑒別荊芥、荊芥穗及其混偽品，為荊芥的種質(zhì)資源鑒定和保證臨床用藥安全提供了良好的技術(shù)手段。

荊芥； ITS2序列； 鑒定； DNA條形碼； 混偽品

荊芥為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）記載其來源為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，具有解表散風(fēng)，透疹，消瘡的功效，常用于感冒、頭痛、麻疹等癥［1］。該物種在《Flora of China》收錄為裂葉荊芥Nepeta tenuifolia Benth.。臨床應(yīng)用中，荊芥藥材混偽品主要為同屬多裂葉荊芥Nepeta multifida L.、荊芥 Nepeta cataria L.、藜科土荊芥 Chenopodium ambrosioides L.。荊芥藥材臨床多采用栽培品［2］，裂葉荊芥（為區(qū)別于混偽品荊芥N.cataria L.，下文荊芥、荊芥穗藥材基原物種稱為裂葉荊芥）靠種子繁殖。據(jù)文獻(xiàn)資料記載［3］，裂葉荊芥子的混偽品主要為車前子，已有學(xué)者對(duì)二者從藥材來源、性狀、顯微、理化等方面進(jìn)行了研究［4-6］，而在分子鑒定方面僅見鄔蘭等［7］對(duì)裂葉荊芥子和車前子進(jìn)行了ITS2序列分析。裂葉荊芥的干燥花穗作為荊芥穗入藥，其混偽品主要為水荊芥（香薷）Elsholtzia ciliata （Thunb.）Hyland.［8］的干燥花穗。目前，對(duì)荊芥藥材、荊芥子和荊芥穗及其混偽品的鑒別缺少綜合性研究與分析。

DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中相對(duì)較短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的新方法，具有簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn)，不受樣品性狀以及研究者的專業(yè)水平限制，適用于中藥材的真?zhèn)舞b定［9-11］。目前，對(duì)植物類藥材來說，ITS2片段是最具優(yōu)勢(shì)的DNA條形碼序列之一［12-13］，已被《中華人民共和國(guó)藥典》收錄［14-15］。本研究運(yùn)用ITS2序列對(duì)荊芥藥材、荊芥子和荊芥穗及其混偽品進(jìn)行鑒定研究，旨在為該藥材的用藥安全及種質(zhì)資源保護(hù)等方面提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料包括7個(gè)物種60份樣品，其中荊芥藥材、荊芥子和荊芥穗樣品共41個(gè)，包括基原植物樣本4份、藥材樣本25份、對(duì)照藥材樣本1份、荊芥子樣本11份和復(fù)核樣本2份，分別來源于陜西秦嶺、湖北神農(nóng)架林區(qū)、國(guó)家藥用植物種質(zhì)資源庫(kù)及河北安國(guó)藥市、安徽亳州藥市、日本東京某漢方藥店等，復(fù)核樣本（樣本號(hào)為YC0176MT07，YC0176MT08）由北京市藥品檢驗(yàn)所、湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證，從GenBank上下載的裂葉荊芥序列6條。裂葉荊芥混偽品序列19條，具體樣本信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 裂葉荊芥干燥葉片及種子樣品取樣量分別為20 mg和50 mg，種子類的樣品研磨后用核分離液［100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol/L EDTA（pH 8.0），0.7 mmol/L NaCl，2% PVP40，0.4% β-巰基乙醇］洗滌3次，均利用植物DNA提取試劑盒（Bioteke Co.，China）提取DNA，按操作說明進(jìn)行。葉片樣品65℃水浴30分鐘，種子類65℃水浴1小時(shí)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 ITS2通常采用引物包括S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3″和 S3R： 5″-GAC GCTTCTCCAGACTACAAT-3′。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃，5 min；94℃，30 s，56℃，30s，72℃45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR反應(yīng)體積為25 μL，參照Chen等［12］的研究方法。電泳查看PCR擴(kuò)增情況，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 對(duì)測(cè)序得到的峰圖利用CodonCode Aligner V 5.1.5進(jìn)行比對(duì)和拼接，去除引物區(qū)，獲得嚴(yán)格一致性序列，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和從GenBank上下載的序列使用基于隱馬爾可夫模型HMMer［16］注釋方法以獲得 ITS2間隔區(qū)序列，然后將所有序列用軟件Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0進(jìn)行分析比對(duì)，并基于 Kimura-2-parameter（K2P）雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)分類樹。

表1 裂葉荊芥及其混偽品的樣品信息

表2 裂葉荊芥及其混偽品ITS2序列種內(nèi)種間K2P距離計(jì)算結(jié)果與變異位點(diǎn)數(shù)目

2 結(jié)果與分析

2.1 裂葉荊芥與其混偽品ITS2序列種內(nèi)種間變異分析

裂葉荊芥葉片和種子不同來源樣品與從GenBank上下載的序列共有41條，序列長(zhǎng)度均為232 bp，G+C含量為66.8%，種內(nèi)無變異位點(diǎn)，K2P遺傳距離為0。荊芥樣品與其混偽品種間序列進(jìn)行比對(duì)后，長(zhǎng)度為281 bp，ITS2序列間變異位點(diǎn)較多，達(dá)151個(gè)，裂葉荊芥與其混偽品的K2P距離范圍為：0.0175～0.6914（見表2）。種間最小K2P距離大于種內(nèi)K2P距離。

2.2 裂葉荊芥及其混偽品的ITS2序列聚類分析

因?yàn)榱讶~荊芥種內(nèi)無變異位點(diǎn)，所以選取其中兩條 ITS2序列（樣本號(hào)：YC0176MT06、YC0176MT19），用MEGA 6.0構(gòu)建裂葉荊芥及其混偽品NJ系統(tǒng)分類樹（圖1），從NJ樹中可以看出，裂葉荊芥聚為一支，其混偽品各自聚為一支。因此，ITS2條形碼序列可將裂葉荊芥及其混偽品很好地區(qū)分開來。

3 討論

3.1 荊芥藥材、荊芥子及荊芥穗的DNA提取

荊芥藥材、荊芥子和荊芥穗采用DNA提取試劑盒一般都能成功提取其DNA，但荊芥子內(nèi)含豐富油脂，研磨時(shí)易被氧化，而且易粘在離心管壁上，損失較大，提取時(shí)應(yīng)加大樣品量，加大聚乙烯吡咯烷酮的使用量，用核分離液洗滌多次，并延長(zhǎng)水浴時(shí)間。在其他種子類藥材DNA提取中也采用類似處理，如凃媛等［17］研究發(fā)現(xiàn)天仙子等種子類藥材65℃水浴3小時(shí)的DNA提取效率較高，宋明等［18］在提取車前子DNA時(shí)用核分離液洗滌三次，以56℃水浴8～9小時(shí)，可以成功提取其所有樣品DNA。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的裂葉荊芥及其混偽品的NJ樹

3.2 應(yīng)用ITS2條形碼鑒定荊芥藥材、荊芥子、荊芥穗及其混偽品的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性

辛天怡等［19］指出DNA條形碼鑒定穩(wěn)定性是指不同產(chǎn)地、不同批次的樣品均能夠穩(wěn)定地獲得DNA條形碼序列。本研究從各地收集了荊芥藥材、荊芥子、荊芥穗的相關(guān)樣品共35個(gè)，均可穩(wěn)定獲得ITS2序列。所有序列經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)均無變異位點(diǎn)，種內(nèi)K2P距離為0，說明采用DNA條形碼鑒定荊芥具有良好的穩(wěn)定性。荊芥與其混偽品ITS2序列變異位點(diǎn)較多，種間K2P距離大于種內(nèi)距離，基于NJ樹也可以明顯區(qū)分荊芥及其混偽品。本研究中荊芥子與其混偽品車前子ITS2序列的研究結(jié)果與鄔蘭等［7］的研究結(jié)果一致。因此，應(yīng)用ITS2條形碼鑒定荊芥藥材、荊芥子、荊芥穗及其混偽品具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3.3 DNA條形碼分子鑒定在實(shí)際工作中的意義

中國(guó)是中藥資源生物多樣性最豐富的國(guó)家［20］。由于中醫(yī)在中國(guó)保健事業(yè)中的重要地位，大量利用中藥已使中國(guó)成為自然資源消費(fèi)的國(guó)際大國(guó)［21］。所以，中藥基原的準(zhǔn)確鑒定對(duì)資源的可持續(xù)利用和臨床療效起著至關(guān)重要的作用。荊芥作為解表透疹藥在臨床上廣泛使用，但市場(chǎng)上荊芥質(zhì)量良莠不齊，存在以次充好、以假亂真的現(xiàn)象，傳統(tǒng)生藥鑒定方法難以滿足現(xiàn)代中藥準(zhǔn)確鑒定的需求。作為傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充，中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則中明確指出，DNA條形碼技術(shù)通過精密度考察和方法適用性考察，確保鑒定結(jié)果穩(wěn)定、可靠［22］。在對(duì)金錢草［23］、砂仁［24］、羌活［19］、大黃［25］、北豆根［26］等藥材DNA條形碼的分析，驗(yàn)證了ITS2條形碼序列用于中藥鑒定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)荊芥藥材、荊芥子和荊芥穗進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，有利于保證藥材在市場(chǎng)上的流通和監(jiān)管，有利于保護(hù)荊芥種質(zhì)資源，從源頭上保證荊芥藥材的質(zhì)量安全和臨床療效。

致謝

感謝北京市藥品檢驗(yàn)所、湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院對(duì)部分樣品進(jìn)行復(fù)核！

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（本文編輯：韓虹娟）

Identification of Schizonepeta tenuifolia Briq.and its adulterants based on ITS2 sequence by DNA barcoding method

ZHOU Jian-guo，WU Lan，MA Shuang-jiao，et al.The Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100193，China

YAO Hui，E-mail：scauyaoh@sina.com

Objective This study aimed to explore a new method to identify the original plant of Schizonepeta tenuifolia Briq.and its adulterants by the ITS2 sequence，and assure its quality and clinical curative effect.Methods Genomic DNA of S.tenuifolia were extracted and then the ITS2 sequences were obtained by direct PCR amplification and sequenced bidirectionally.All data of sequences were analyzed by software MEGA 6.0，the Kimura 2-Parameter（K2P）distances were calculated，and the phylogenetic tree was constructed by the neighbor joining（NJ）method.Results The sequence length of the ITS2 of Schizonepeta tenuifolia was 232bp，and the G+C content was 66.8%.The intra-specific variation was highly conservative.There were many variation sites of ITS2 sequences between Schizonepeta tenuifolia Briq.and its adulterants.The results showed that the minimum inter-specific divergence was 0.0175，which was larger than the maximum intra-specific divergence.The NJ tree indicated that Schizonepeta tenuifolia could be distinguished from its adulterants obviously.Conclusion The ITS2 region can be used as a barcode for identification of Schizonepeta tenuifolia Briq.，which provide a new technique for the authentication of germplasm resouces and ensure clinical safety in utilization of traditional Chinese medicine.

Schizonepeta tenuifolia Briq； ITS2 sequence； Identification； DNA barcoding；Adulterants

重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09304307001）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAI07B08）

100193 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室［周建國(guó)（碩士研究生）、馬雙姣（碩士研究生）、石林春、金鉞、姚輝］；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所［鄔蘭（博士研究生）］

周建國(guó)（1993-），2015級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中藥資源與分子鑒定。E-mail：1312905813 @qq.com

姚輝（1976-），博士，研究員。研究方向：中藥資源學(xué)。E-mail：scauyaoh@sina.com

R282.5

A doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.08.005

（2016-03-01）