江大雷

連續(xù)跳躍條件下兔髕骨髕腱結(jié)合部組織形態(tài)學(xué)及相關(guān)生長因子表達特征

江大雷1，2

目的：探討連續(xù)跳躍運動條件下兔髕骨髕腱結(jié)合部內(nèi)外側(cè)區(qū)域形態(tài)學(xué)，以及膠原蛋白、血管生成等相關(guān)生長因子的表達特征。方法：18周齡雌性新西蘭大白兔10只，隨機分為跳躍組（JE）和對照組（Con），每組5只，JE組每天在電刺激下跳躍150次，每周訓(xùn)練5天，對照組不予任何處理。4周后，取雙下肢髕骨髕腱復(fù)合體，行HE染色、番紅染色和免疫組化染色。結(jié)果：與Con組相比，JE組髕骨髕腱結(jié)合部細胞密度、纖維軟骨帶厚度、粘多糖蛋白區(qū)域面積顯著增加，JE組髕骨髕腱結(jié)合部內(nèi)側(cè)區(qū)域細胞密度顯著低于外側(cè)區(qū)域（P＜0.05），內(nèi)側(cè)區(qū)域纖維軟骨帶厚度顯著高于外側(cè)區(qū)域（P＜0.05）；與Con組相比，JE組髕骨髕腱結(jié)合部CollagenⅢ，HIF-1α，VEGF和BMP-2陽性染色細胞密度顯著增高；JE組外側(cè)區(qū)域CollagenⅢ表達顯著高于內(nèi)側(cè)區(qū)域（P＜0.05），外側(cè)區(qū)域HIF-1α和VEGF表達顯著高于內(nèi)側(cè)區(qū)域（P＜0.01）。結(jié)論：連續(xù)跳躍運動下，兔髕骨髕腱結(jié)合部內(nèi)側(cè)與外側(cè)區(qū)域呈現(xiàn)不同的損傷形態(tài)學(xué)變化特點，外側(cè)區(qū)域Ⅲ型膠原蛋白、低氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長因子表達高于內(nèi)側(cè)區(qū)域。

髕骨髕腱結(jié)合部；過度使用性損傷；組織形態(tài)學(xué)；生長因子；髕腱腱病

髕骨髕腱結(jié)合部（Patella-Patellar Tendon Junction，PPTJ）是一個連接髕骨和髕腱2種完全不同組織的復(fù)雜過渡區(qū)域［1］，在反復(fù)過度的爆發(fā)性跳躍運動條件下，出現(xiàn)過度使用性損傷，臨床主要表現(xiàn)為前膝部活動痛、局部腫脹伴隨髕腱處按壓痛［2］，常被稱之為跳躍膝（Jumper's knee）。多見于體育運動人群，尤其是排球、跳高、跳高和跳遠等跳躍較多的運動項目，優(yōu)秀排球運動員的發(fā)病率約為44.6%，優(yōu)秀籃球運動員的發(fā)病率約為31.9%［3］。由于遷延難愈，影響運動訓(xùn)練和比賽成績，甚至導(dǎo)致運動員運動生涯的終止，是困擾運動員和教練員的運動醫(yī)學(xué)難題之一。

髕腱腱病病理標本顯示，PPTJ區(qū)域出現(xiàn)粘液性變或玻璃樣變，出現(xiàn)透明軟骨或骨組織、血管、瘢痕組織［4］。而PPTJ內(nèi)側(cè)區(qū)域（近髕尖部位）病理變化尤為顯著，出現(xiàn)明顯鈣化或骨化現(xiàn)象，與局部所承受應(yīng)力類型不同且應(yīng)力分布不均有關(guān)［5］。動物實驗結(jié)果表明，PPTJ過度使用性損傷表現(xiàn)為細胞密度增加且分布紊亂，膠原纖維排列紊亂，潮線模糊或消失，纖維軟骨區(qū)增厚，甚至出現(xiàn)血管和瘢痕組織［6-7］。但動物研究病理結(jié)果均未論及PPTJ局部組織病理學(xué)變化的區(qū)域差異特點，本研究通過動物模型，描述和研究這一病理特征，進一步揭示PPTJ過度使用性損傷病理變化特征。

PPTJ病理變化與膠原蛋白和局部生長因子的表達變化關(guān)系密切，其中，膠原Ⅲ維持正常的膠原基質(zhì)和膠原基質(zhì)的再生發(fā)揮重要的作用，腱病病理組織及過度使用性損傷組織ColⅢ表達增加［8-9］。VEGF，CTGF和bFGF等生長因子表達增加與過度使用性損傷瘢痕組織形成有關(guān)［10-12］，BMP表達持續(xù)增高導(dǎo)致局部發(fā)生異位鈣化以及骨刺形成［13］。但未見PPTJ局部相關(guān)細胞因子表達區(qū)域差異的相關(guān)研究。本研究推測，在連續(xù)跳躍條件下，PPTJ局部組織承受不同應(yīng)力作用，相關(guān)生長因子表達呈現(xiàn)區(qū)域差異，與組織病理學(xué)變化的區(qū)域差異相關(guān)，進一步闡釋PPTJ過度使用性損傷的機制。

目前，動物模型建立尚存在不足，如“高壓電電擊跳躍法”［14］采用高電壓微電流設(shè)備刺激兔跳躍，但跳躍過程不易控制；定量化循環(huán)載荷訓(xùn)練［6，15-16］對局部產(chǎn)生的應(yīng)力刺激較小。反復(fù)高強度的應(yīng)力刺激是髕腱過度使用性損傷的主要發(fā)病原因，跳躍過程中髕腱受力可以達到體重的7～10倍以上［17］。本研究采用自行設(shè)計的動物模型，通過電刺激促使兔進行穩(wěn)定可控的跳躍動作，探討連續(xù)跳躍運動條件下PPTJ組織形態(tài)學(xué)及相關(guān)因子表達的區(qū)域特征，進一步闡明PPTJ過度使用性損傷的病理特征，并為該損傷預(yù)防和治療效果評價奠定基礎(chǔ)。

1　研究對象與方法

1.1實驗動物及分組

18周齡雌性新西蘭大白兔購于北京興隆實驗動物中心（許可證號：SCXK（京）2011-0006），購入后飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)實驗動物房，環(huán)境溫度為20～22℃，環(huán)境濕度為55%～65%，燈光模擬晝夜變換（8∶00-18∶00），單籠飼養(yǎng)，進食國家標準動物飼料，自由活動，訓(xùn)練組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進行預(yù)訓(xùn)練5天。10只兔隨機分為4周組（JE）和對照組（Con），每組5只，體重為（2.92± 0.17）kg。進行正式實驗，JE組進行跳躍訓(xùn)練，對照組不予任何處理，本實驗設(shè)計通過北京體育大學(xué)動物實驗倫理委員會的審核。

1.2動物訓(xùn)練方法

采用前期研究建立的兔跳躍裝置［18］，該裝置主要由長方形跳籠、kistler測力臺（Type 9286AA，Kistler Instrumente AG，Switzerland）、脈沖電刺激器（型號：RM-6240C，四川成都儀器廠）、電腦及配套軟件構(gòu)成。

兔跳躍訓(xùn)練方法：兔雙后肢腳掌中間部位局部剃毛，暴露皮膚，70%酒精脫脂后，涂抹適量導(dǎo)電膏，并采用彈性膠布纏繞固定電極貼片，與電刺激器連接，置于跳籠中，上肢采用套索裝置提起，身體與地面呈約60°，雙后肢著地，站立于跳籠底部的測力臺上，刺激器發(fā)出電刺激引發(fā)兔跳躍，每次跳躍后，將兔放回原起跳位置，恢復(fù)跳躍前準備姿勢，進行下一次跳躍。采用測力臺自帶Bioware軟件同步記錄兔跳躍蹬地力學(xué)數(shù)據(jù)和跳躍曲線，記錄起跳時蹬地峰值力，監(jiān)控兔跳躍情況。

兔跳躍訓(xùn)練方案：適應(yīng)性喂養(yǎng)后，進行適應(yīng)性訓(xùn)練5天，每天跳躍次數(shù)依次遞增，分別為30，50和100次，每次訓(xùn)練要求刺激電壓從低到高，逐級遞增電壓，在盡量減少情緒緊張的同時，形成穩(wěn)定的跳躍模式，當兔對電刺激強度產(chǎn)生一定適應(yīng)或運動疲勞時，可適當增加電壓，電壓不超過30 V。最終形成的跳躍方式是一次電刺激引起兔單次跳躍，每次跳躍為全力跳躍（根據(jù)測力臺記錄蹬地峰值力判斷），每次跳躍后將兔返回原來跳躍位置，跳躍前身體姿勢要求基本一致。預(yù)實驗結(jié)束后，進行正式實驗。正式實驗：每天跳躍150次，共分為15組，每組跳躍10次，每20 s跳一次，組間休息3 min，每跳躍50次休息10 min，每只兔子每次訓(xùn)練跳躍時間為2 h，每周訓(xùn)練5天。

脈沖電刺激器參數(shù)設(shè)置：采用正電壓刺激，刺激模式為串單刺激；輸出電壓強度為20～30 V；波寬（2 ms）、脈沖間隔為8 ms，脈沖組數(shù)為20。

1.3取材及處理

最后1次跳躍訓(xùn)練結(jié)束后24 h，取雙側(cè)下肢髕骨-髕腱-脛骨結(jié)節(jié)復(fù)合體（見圖1），25%戊巴比妥鈉腹腔注射處死，立即切開兔膝前部皮膚，暴露整個膝關(guān)節(jié)前部，于髕骨上方1 cm處，橫斷股四頭肌末端肌腱，將髕骨-髕腱-脛骨結(jié)節(jié)復(fù)合體取下。生理鹽水沖洗后，迅速放入4%多聚甲醛溶液，固定48 h。固定結(jié)束后，移入10%甲酸溶液中脫鈣3周，針刺確定脫鈣終點，將髕骨-髕腱復(fù)合體標本沿髕腱正中切斷，沿正中矢狀面切開，流水沖洗12 h，放入70%乙醇溶液保存，集中進行脫水、包埋處理?？v行切片，切片厚度為5 μm。

1.4組織染色

HE染色用于描述細胞排列、分布，潮線清晰度，膠原排列。具體步驟：石蠟切片放入烤箱，60℃烤片20 min，二甲苯脫蠟2× 10 min，100%，95%，80%和70%梯度乙醇至蒸餾水各2 min，蘇木精染色15 min，蒸餾水2 min，1%鹽酸乙醇分化5～7 s，1%氨水返藍1 min，伊紅復(fù)染5 min，流水沖洗，70%，80%，95%，100%和100%乙醇脫水各2 min，二甲苯2×5 min，樹膠封片。

番紅染色用于觀察粘多糖蛋白分布特征，并計算區(qū)域面積。具體步驟：石蠟切片放入烤箱，60℃烤片20 min，二甲苯脫蠟2×10 min，100%，95%，80%和70%梯度乙醇至蒸餾水各2 min，0.1%固綠（0.1%，Ackas，Belgium）1 min，1%醋酸10 s，0.1%番紅（0.1%，Ackas，Belgium）30 min，80%，95%，100%和100%乙醇脫水各2 min，二甲苯2×5 min，樹膠封片。

免疫組化染色從膠原蛋白和血管生成相關(guān)因子表達變化等方面探討PPTJ損傷病理變化特征。具體步驟：采用三步法免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片放入烤箱，60℃烤片20 min，二甲苯脫蠟2×10 min，100%，95%，80%和70%梯度乙醇至蒸餾水各2 min，0.01%PBS 3×5 min，0.1%胰酶37℃抗原修復(fù)處理30 min，0.01%PBS 3×5 min，3%雙氧水清除內(nèi)源性過氧化物15 min，0.01%PBS 3×5 min，10%羊血清蛋白封閉15 min，傾去，添加一抗（1∶100）4℃過夜，次日37℃復(fù)溫30 min，添加生物素化二抗工作液（IgG/Bio）室溫下孵育20 min，0.01%PBS 3×5 min，添加辣根酶標記鏈霉卵蛋白工作液（S-A/HRP）室溫孵育20 min。0.01%PBS 3×5 min，DAB顯色5～7 min，流水沖洗15 min，80%，95%，100%和100%乙醇脫水各2 min，二甲苯2×5 min，樹膠封片。

圖1　髕骨-髕腱復(fù)合體Figure1　Patellar-patellar tendon complex

免疫組化染色所用一抗及相關(guān)試劑均購買于北京博奧森生物技術(shù)有限公司（Beijing biosynthesis biotechnology co.，LTD），抗體稀釋比例均為1∶100，包括I型膠原蛋白（Collagen I，bs-0578R）、Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ，bs-0549R）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α，bs-0737R）、血管內(nèi)皮生長因子抗體（VEGF，bs-1665R）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2，bs-1012R）。

1.5測試指標

1.5.1組織學(xué)評定（1）纖維軟骨帶寬度。采用圖像分析軟件（MetaMorph Premier Offline Version 7.7，USA），根據(jù)細胞形態(tài)標記出纖維軟骨帶區(qū)域，包含鈣化軟骨和纖維軟骨（見圖2）。纖維軟骨帶厚度即為鈣化軟骨與骨交界處與纖維軟骨和肌腱交界處之間的平均寬度。評定采用2人單獨盲法評定，取平均值。

（2）細胞密度。每張切片沿著PPTJ區(qū)域拍攝100×圖像，采用圖像分析軟件（MetaMorph Premier Offline Version 7.7，USA）進行細胞計數(shù)。根據(jù)上述纖維軟骨帶標記區(qū)域，在區(qū)域中選取5個面積為104μm2（100 μm×100 μm）的正方形，均勻分布在區(qū)域內(nèi)，計算5個正方形區(qū)域內(nèi)細胞個數(shù)平均值［10］，記為該標本的細胞密度（見圖3）。由于髕腱結(jié)合部區(qū)域內(nèi)側(cè)（Inner zone）與外側(cè)區(qū)域（outer zone）組織病理學(xué)變化不同，參考NAKAMA的研究方法［7］，將其分為內(nèi)外2個部分進行評定，評定采用2人單獨盲法評定，取平均值（見圖4）。

圖2　髕骨髕腱結(jié)合部纖維軟骨帶厚度測定方法（100×）標尺長度：100 μmFigure2　Measurement method of fibrocartilage zone thickness in PPTJ bar：100 μm

圖3　髕骨髕腱結(jié)合部細胞密度測定方法（100×）標尺長度：100 μmFigure3　Measurement method of cell density in PPTJ bar：100 μm

圖4　髕骨髕腱結(jié)合部內(nèi)外側(cè)區(qū)域標示方法（20×）標尺長度：1 000 μmFigure4　Labeling method of Inner and Outer zone in PPTJ bar：1 000 μm

（3）Safranin O染色。觀察粘多糖蛋白分布特征，并計算區(qū)域面積。光學(xué)纖維鏡依次拍20×和100×照片。

1.5.2免疫組化評價方法參考L.H.NAKAMA等［12］的研究，采用Nikon 50i光學(xué)顯微鏡依次拍攝20×、40×、100×和400×照片，其中400×下從PPTJ髕尖側(cè)開始，連續(xù)拍攝5張圖片。獲取圖像之前，對圖像進行白平衡處理，保證所有圖片在統(tǒng)一背景顏色下拍攝，并保證每次拍攝時調(diào)節(jié)光強度在統(tǒng)一水平，以保證背景灰度平均值一致性。采用圖像分析軟件（MetaMorph Premier Offline Version 7.7，USA）計算陽性染色細胞數(shù)目，除以圖像面積，計算陽性染色細胞密度。

1.6數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計方法

所有定量數(shù)據(jù)以M±SD表示，采用單因素方差分析，Post hoc檢驗采用LSD檢驗，顯著性水平為P＜0.05，非常顯著性水平為P＜0.01。

2　結(jié)果

2.1組織病理學(xué)變化

2.1.1組織學(xué)的定性描述髕腱結(jié)合部組織學(xué)變化。HE染色：Con組潮線清晰可辨，曲線平滑，弧度與髕骨輪廓一致，纖維軟骨帶層次清楚，細胞分布均勻；JE組內(nèi)側(cè)區(qū)域可見潮線消失，纖維軟骨帶與肌腱細胞邊界區(qū)域不清晰，細胞分布異常，排列紊亂，局部區(qū)域出現(xiàn)纖維軟骨細胞聚集（見圖5D實心箭頭所示），周圍區(qū)域出現(xiàn)無細胞區(qū)域（見圖5D空心箭頭所示），外側(cè)區(qū)域可見潮線消失，細胞數(shù)目明顯增多，橢圓形或圓形腱細胞數(shù)量增加，纖維軟骨細胞增多，呈串狀排列（見圖5G實心星狀所示），纖維軟骨帶區(qū)域范圍增加。偏振光圖像：Con組膠原纖維排列整齊致密，折光性能好，軟骨區(qū)域細胞囊成像清晰可辨；JE組內(nèi)側(cè)區(qū)域膠原纖維折光性能明顯降低，纖維排列紊亂，纖維走向混亂，肌腱、纖維軟骨帶和骨之間界限不清，外側(cè)區(qū)域膠原纖維排列紊亂，各區(qū)域界限不清，膠原褶皺現(xiàn)象顯著。Safranin O圖像：Con組粘多糖區(qū)域局限，紅染區(qū)域分布均勻分散，沿膠原纖維走向分布，主要分布在纖維軟骨帶區(qū)域；JE組內(nèi)側(cè)區(qū)域粘多糖區(qū)域擴大，分布不勻，近髕尖處出現(xiàn)片狀或團塊狀濃染區(qū)域（見圖5F空心星狀所示），外側(cè)區(qū)域紅染區(qū)域分布明顯增加，部分擴散至肌腱區(qū)域，分布不均勻（見圖5I空心星狀所示）。

圖5　髕骨髕腱結(jié)合部區(qū)域病理學(xué)變化比較（100×）Figure5　Pathological changes of PPTJ in each group

2.1.2組織學(xué)變化的定量描述PPTJ內(nèi)側(cè)區(qū)域結(jié)果顯示，與Con組相比，細胞密度（P＜0.05）、纖維軟骨帶寬度（P＜0.01）和粘多糖蛋白區(qū)域面積（P＜0.05）顯著增加。PPTJ外側(cè)區(qū)域顯示，與Con組相比，細胞密度（P＜0.01）、纖維軟骨帶寬度（P＜0.05）和粘多糖蛋白區(qū)域面積（P＜0.05）顯著增加（見表1）。

JE組PPTJ內(nèi)外側(cè)相比較，內(nèi)側(cè)區(qū)域細胞密度低于外側(cè)區(qū)域（P＜0.05），內(nèi)側(cè)區(qū)域纖維軟骨帶厚度顯著高于外側(cè)區(qū)域（P＜0.05），內(nèi)側(cè)區(qū)域粘多糖蛋白面積與外側(cè)區(qū)域差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。

表1　各組髕骨髕腱結(jié)合部區(qū)域組織病理學(xué)變化（M±SD）Table1　Pathological changes of PPTJ in each group（M±SD）

2.2各組CollagenⅠ和CollagenⅢ陽性染色細胞密度的比較

與Con組相比，JE組PPTJ內(nèi)側(cè)區(qū)域CollagenⅢ陽性染色細胞密度增高有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），ColⅢ/ColⅠ比值顯著增加（P＜0.01）；外側(cè)區(qū)域CollagenⅢ顯著增高（P＜0.01），ColⅢ/ColⅠ比值顯著增加（P＜0.01），JE組外側(cè)區(qū)域CollagenⅢ表達顯著高于內(nèi)側(cè)區(qū)域（P＜0.05）（見表2、圖6）。

表2　各組CollagenⅠ和CollagenⅢ陽性染色的比較Table2　Comparison of CollagenⅠand CollagenⅢprotein between groups

圖6　PPTJ區(qū)域CollagenⅠ和CollagenⅢ陽性染色細胞圖像（400×）Figure6　Expression of CollagenⅠand CollagenⅢprotein in PPTJ region

2.3各組HIF-1α、VEGF和BMP-2陽性染色細胞密度的比較

與Con組相比，JE組PPTJ內(nèi)側(cè)區(qū)域HIF-1α陽性染色細胞密度增高有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），VEGF表達也增加（P＜0.05）；外側(cè)區(qū)域HIF-1α和VEGF顯著增高（P＜0.01），且顯著高于內(nèi)側(cè)區(qū)域（P＜0.01）。與Con組相比，PPTJ區(qū)域BMP-2陽性染色細胞密度增高（P＜0.05），內(nèi)外側(cè)區(qū)域差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表3、圖7）。

表3　各組HIF-1α、VEGF和BMP-2陽性染色的比較Table3　Comparison of HIF-1α，VEGF and BMP-2 protein between groups

圖7　PPTJ區(qū)域HIF-1α、VEGF和BMP-2陽性染色細胞圖像（400×）Figure7　Expression of HIF-1α、VEGF and BMP-2 protein in PPTJ region

3　討論

本研究采用的兔跳躍裝置［18］的主要特點是：兔前肢懸起，后肢著地，每次跳躍身體保持相同姿勢，通過腳底電極電刺激跳躍，單次電刺激形成一次跳躍，保證了兔的跳躍穩(wěn)定性，采用測力臺記錄起跳階段蹬地力峰值，監(jiān)控兔跳躍情況。兔性格相對溫順，使得實驗過程易于控制。此外，兔組織標本相對較大，與人在細胞和組織生理特性方面更為接近［8］。

參考相關(guān)研究［19］，結(jié)合本研究預(yù)實驗結(jié)果，進行4周的跳躍運動，組織學(xué)結(jié)果提示，兔PPTJ局部出現(xiàn)了慢性損傷性改變，如膠原纖維紊亂、局部細胞數(shù)目增多且排列紊亂、粘多糖蛋白分布增多［6-7］。PPTJ外側(cè)區(qū)域組織表現(xiàn)為細胞數(shù)目顯著增多，分布不均；而內(nèi)側(cè)區(qū)域組織則表現(xiàn)為纖維排列更加紊亂，局部出現(xiàn)大量的細胞簇集現(xiàn)象尤為突出，纖維軟骨細胞增殖明顯，細胞分布紊亂且粘多糖蛋白分布不均，出現(xiàn)大量團塊狀染色，且這與人類髕腱腱病標本病理部位是一致的［20］。臨床研究表明，髕腱腱病的主要病變部位發(fā)生在髕腱止點處，超聲成像及MRI顯示，髕腱止點的后部肌腱部分出現(xiàn)明顯異常信號［21］。研究表明，髕腱的力學(xué)分布在不同部位并不均勻，髕腱結(jié)合部外側(cè)區(qū)域主要承受牽拉力的作用，而內(nèi)側(cè)承受更為復(fù)雜的應(yīng)力作用，除了牽拉力作用以外，該部位承受了較大的壓力和剪切力［5］。O.BASSO等［22］采用尸體進行模擬研究，施加負荷是1 kN，測定角度是60°～90°，結(jié)果表明，髕腱上端后部區(qū)域受力較大，提示局部病變與應(yīng)力集中有關(guān)。采用二維有限元方法估算髕腱受力情況，實驗前后采用超聲判斷髕腱局部損傷情況，結(jié)果表明，髕腱上端后部局部應(yīng)力顯著增高，3具尸體局部標本在此部位出現(xiàn)了明顯的腱纖維撕裂［20］。E.M.DILLON等［23］采用光纖維技術(shù)在體研究測定髕腱上端不同部位受力情況，在不同運動方式下，包括股四頭肌閉鏈運動和開鏈運動進行測定，結(jié)果表明，髕腱上端后部承受的力要更高于與其對應(yīng)的前部，局部應(yīng)力集中造成了組織損傷。PPTJ內(nèi)側(cè)區(qū)域和外側(cè)區(qū)域承受不同應(yīng)力作用是PPTJ組織形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)不同變化的原因。也表明，本研究跳躍模型較好地模擬了人類髕骨髕腱結(jié)合部過度使用性損傷的病理特征。

纖維軟骨基質(zhì)部分組成與肌腱基本相似，主要表達ColⅠ和Ⅲ，還表達ColⅡ［24］。本研究也表明，PPTJ內(nèi)側(cè)區(qū)域和外側(cè)區(qū)域ColⅢ相對于Con組表達增強，ColⅢ/ColⅠ比值增加，ColⅢ表達增加。ColⅢ表達增多是組織內(nèi)源性修復(fù)的重要方式，但當ColⅢ所占比例增加，ColⅢ/ColⅠ增加會導(dǎo)致肌腱膠原纖維排列失去正常排列，生物力學(xué)性能下降［25］。PPTJ內(nèi)側(cè)區(qū)域ColⅢ表達低于外側(cè)區(qū)域，推測內(nèi)側(cè)區(qū)域壓應(yīng)力促使軟骨化生，纖維軟骨細胞ColⅡ表達升高［26］，而牽拉應(yīng)力條件下ColⅢ增多促進組織修復(fù)［27］。

PPTJ區(qū)域是典型缺少血管的區(qū)域，其血液供應(yīng)來源周圍組織的彌散作用，這種低氧狀態(tài)與組織低代謝需求及功能需要有關(guān)［28］。一旦損傷該區(qū)域的修復(fù)能力較差，需要更長的修復(fù)時間，如果修復(fù)過程尚未結(jié)束而再次承受重復(fù)損傷刺激，最終導(dǎo)致局部組織修復(fù)失敗，局部病理發(fā)生。本研究中，纖維軟骨帶HIF-1α表達量明顯增高，表明在反復(fù)跳躍條件下，組織局部出現(xiàn)了明顯的缺氧情況，這與局部PPTJ區(qū)域本身血供較差有關(guān)，也與組織產(chǎn)生損傷后，局部啟動修復(fù)反應(yīng)，組織代謝水平提高有關(guān)。VEGF是最為重要的促進血管生成的糖基化蛋白，可刺激內(nèi)皮細胞增殖、存活及遷移和血管形成，并可提高血管通透性，促進纖維蛋白原等在細胞外基質(zhì)中的沉積，為成纖維細胞提供臨時基質(zhì)［29］。內(nèi)側(cè)區(qū)域VEGF的表達相對于Con提高了41%，而外側(cè)區(qū)域相對于內(nèi)側(cè)區(qū)域提高了92%。內(nèi)外區(qū)域表達不相同，可能與骨腱結(jié)合部纖維軟骨帶應(yīng)力分布不同有關(guān)。在體外研究中，牽拉應(yīng)力導(dǎo)致細胞VEGF表達增多，但壓力導(dǎo)致VEGF表達降低，纖維軟骨帶內(nèi)側(cè)區(qū)域承受的壓應(yīng)力可能抑制VEGF的表達，而外側(cè)區(qū)域承受的牽拉應(yīng)力促進了VEGF的表達［12］。

BMP是多功能生長因子，屬于TGF-β超家族，在促進臨床上骨腱結(jié)合部再生方面研究較多，目前研究較多且較為深入的是BMP-2［30］，具有促進成軟骨或成骨作用［31］。本研究Con組中BMP-2表達較低，而JE組表達顯著增高，跳躍運動可造成PPTJ尤其內(nèi)側(cè)區(qū)域承受強大的壓應(yīng)力和剪切力是主要原因。雖然JE組PPTJ內(nèi)側(cè)纖維軟骨帶區(qū)域顯著高于外側(cè)，但BMP表達內(nèi)外側(cè)間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與實驗時間短有關(guān)。在過度使用性損傷過程中，BMP表達的持續(xù)增高可能會導(dǎo)致局部發(fā)生異位鈣化和骨刺形成［32］。

綜上，本研究首次通過動物實驗表明連續(xù)跳躍運動條件下，PPTJ內(nèi)外側(cè)區(qū)域生長因子表達不同，組織病理學(xué)變化存在明顯差異，與局部承受的應(yīng)力不同有關(guān)。體外研究采用牽拉應(yīng)力［33］、壓應(yīng)力或剪切應(yīng)力對肌腱干細胞分化的研究［34］對理解相關(guān)機制具有重要作用。

4　結(jié)論

（1）連續(xù)跳躍運動條件下，髕骨髕腱結(jié)合部區(qū)域出現(xiàn)損傷性改變，內(nèi)側(cè)與外側(cè)區(qū)域變化不同，可能與承受不同的應(yīng)力作用有關(guān)。（2）髕骨髕腱結(jié)合部外側(cè)區(qū)域CollagenⅢ、HIF-1α和VEGF表達顯著高于內(nèi)側(cè)區(qū)域。

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Characteristics of Patella-Patellar Tendon Junction in Histomorphology and Expression of Related Growth FactorsundertheConditionofContinuousjumping

JIANG Dalei1，2
（1.School of PE，Henan Normal University，Xinxiang 461000，China；2.School of Graduate，Beijing Sports University，Beijing 100084，China）

Objective：To investigate the morphologic features and expression of related growth factor of Patella-Patellar Tendon Junction（PPTJ）injury caused by continuous jumping.Methods：Eighteen weeks old female New Zealand white rabbits were randomly divided into JE groups（JE）and control group （Con），with 5 rabbits in each group.Jumping scheme was 150 times a day，5 days a week.Patella-patellar tendon complex was harvested 4 weeks later，paraffin section were stained by HE and Safranin O to observe the histopathologic changes，Immunohistochemistry was used to display the expression of related growth factors.Results：Compared with Con group，Cell density and Fibrocartilage zone thickness and Glycosaminoglycan area was significantly increased. Cell density in PPTJ inner zone was lower than that in PPTJ outer zone（P＜0.05），whereas Fibrocartilage zone thickness in PPTJ inner zone was larger than that of PPTJ outer zone（P＜0.05）.The expression of CollagenⅢ，HIF-1α，VEGF and BMP-2 in PPTJ zone of JE group was higher than that of Con group. The expression of CollagenⅢin PPTJ outer zone of JE group was higher than that of PPTJ inner zone（P＜0.05），while HIF-1α and VEGF was higher（P＜0.01）.Conclusion：Continuous jumping lead to PPTJ overuse injury，Pathological changes in PPTJ inner zone was different from that of PPTJ outer zone.The expression of CollagenⅢ，HIF-1α and VEGF in PPTJ outer zone was higher than that of PPTJ inner zone.

patella-patellar tendon junction；overuse injury；histomorphology；growth factor；patellar tendinopathy

G 804.5

A

1005-0000（2016）02-141-06

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2016.02.009

2015-11-01；

2016-02-21；錄用日期：2016-02-22

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資助課題（項目編號：2014BS015）；河南師范大學(xué)博士啟動課題資助（項目編號：qd15191）

江大雷（1981-），男，安徽宿州人，博士，講師，研究方向為運動與健康、運動損傷的預(yù)防與康復(fù)。

1.河南師范大學(xué)體育學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.北京體育大學(xué)研究生部，北京100084。