周翔宇，鄭英強，何雪梅

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血管和甲狀腺外科，四川瀘州 646000)

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RIP1在急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡中的作用探討*

周翔宇，鄭英強，何雪梅

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血管和甲狀腺外科，四川瀘州 646000)

目的探討細胞凋亡在急性胰腺炎炎癥中的作用及受體相互作用蛋白(RIP)的調控作用。方法將30只C57小鼠分為3組：對照組、急性水腫性胰腺炎(AEP)組、急性壞死性胰腺炎(ANP)組。AEP組連續(xù)注射雨蛙素(50 μg/kg)13次；ANP組連續(xù)注射雨蛙素(50 μg/kg)13次，另注射1次脂多糖(15 mg/kg)；對照組注射等量生理鹽水7次。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記法觀察胰腺腺泡細胞凋亡，實時熒光定量PCR法檢測RIP1 mRNA的表達，蛋白質免疫印跡法檢測RIP1蛋白的表達。結果成功建立AEP及ANP小鼠模型。與對照組比較，2個胰腺炎模型組均存在細胞凋亡，且與AEP組比較，ANP組小鼠細胞凋亡減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，AEP組RIP1 mRNA及蛋白表達均升高，而ANP組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論RIP1參與急性胰腺炎的發(fā)病過程，可能與調控腺泡細胞凋亡有關。

急性胰腺炎；水腫性胰腺炎；壞死性胰腺炎；細胞凋亡；受體相互作用蛋白

急性胰腺炎是多種病因導致胰酶在胰腺內被激活后，引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎性反應?，F(xiàn)有的研究認為，實驗性胰腺炎炎癥程度與腺泡細胞的凋亡呈負相關[1]。胰腺腺泡細胞的凋亡對于急性胰腺炎的臨床轉歸是一個有利的保護性反應[2]。但胰腺腺泡細胞凋亡的調控機制尚不明確。本研究建立急性水腫性胰腺炎(acute edematous pancreatitis，AEP)和急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)小鼠模型，檢測兩種模型胰腺腺泡細胞凋亡及凋亡調控基因受體相互作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)在胰腺腺泡細胞的表達，進一步探討細胞凋亡在胰腺炎癥中的作用及相關調控機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物30只雄性C57小鼠購自重慶騰鑫生物技術有限公司，10周齡,體質量22～24 g。

1.2儀器與試劑雨蛙素和脂多糖均購自美國Sigma公司，血清淀粉酶和脂肪酶檢測試劑盒均購自南京建成生物制品研究所，Trizol及SYBR Green Master Mix試劑均購自美國Life Technologies公司，StepOne Plus實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司，熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記(TUNEL)試劑盒購自瑞士Roche公司,RIP單克隆抗體和內參β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗購自美國Abcom公司。

1.3方法

1.3.1模型建立急性胰腺炎動物模型的建立參考文獻[3]。將所有動物于實驗前適應性喂養(yǎng)1周，術前禁食12 h，自由飲水。將30只小鼠分為3組：對照(CON)組、AEP組、ANP組。AEP組小鼠腹腔注射雨蛙素50 μg/kg，連續(xù)7次，每次間隔1 h；ANP組小鼠腹腔注射雨蛙素50 μg/kg，連續(xù)13次，每次間隔1 h，在最后1次注射雨蛙素時加注1次脂多糖(15 mg/kg)；CON組腹腔注射與雨蛙素相同劑量的生理鹽水，注射7次。

1.3.2標本收集和組織學檢測于最后1次注射后3 h用3%戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)行腹腔內注射麻醉，下腔靜脈抽取血液0.5～1.0 mL，3 000 r/min離心10 min分離血漿，試劑盒測定血清淀粉酶和脂肪酶含量。取胰腺組織，常規(guī)固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，行病理檢查。

1.3.3TUNEL法檢測胰腺腺泡細胞凋亡每只小鼠蠟塊任選3張切片，二甲苯脫蠟后，按照說明書測定細胞凋亡情況。加 TUNEL反應液，再加入轉化劑-POD(converter-POD)，然后與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應顯色，光學顯微鏡觀察并計數(shù)。TUNEL陽性表達率=陽性表達細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.4實時熒光定量PCR檢測RIP mRNA的表達取胰腺組織，每塊1 cm3，迅速置于-80 ℃凍存。引物序列，RIPF：5′-CGG GTG TCA GGA ATC AAA TC-3′，RIPR：5′-TGG AAG GTC TCG CAA ATA CTG-3′；β-actinF：5′-AGG GTG TGA TGG TGG GAA T-3′，β-actin R：5′-CTC GGT GAG CAG CAC AGG-3′。按照RNA抽提試劑盒的操作步驟，取凍存胰腺組織50 mg提取總RNA，并利用紫外分光光度計對提取的RNA濃度進行測定，并制備cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測RIP mRNA。經過最后的循環(huán)后，用PCR擴增儀自帶軟件進行熒光定量分析。實時熒光定量PCR檢測結果使用比較閾值法進行定量分析，分析方法采用2-△△Ct方法。

1.3.5蛋白質免疫印跡(Western blotting)檢測RIP蛋白在胰腺組織的表達按蛋白提取試劑盒說明書提取各組小鼠胰腺組織總蛋白。蛋白濃度由二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定。對所提取的蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉后，加入一抗，4 ℃孵育過夜。加入過氧化物酶(HRP)標記的二抗，電化學發(fā)光(ECL)法顯色。用Quantity One軟件測定各條帶的積分吸光度值。鼠單克隆抗體β-actin作為內參對照。

2　結　　果

2.1病理切片觀察AEP組小鼠胰腺呈現(xiàn)典型AEP改變,小葉間隙增寬、水腫、充血，有中性粒細胞和單核細胞浸潤，腺泡細胞腫脹，但小葉結構完好，未見明顯出血壞死，部分細胞內脂質空泡形成。ANP組小鼠胰腺組織結構破壞明顯，小葉排列紊亂，葉間有明顯的炎性反應、水腫，小葉邊緣區(qū)大量腺泡細胞壞死，局部有融合性壞死灶，局部血管壁出血、壞死，脂肪組織壞死。CON組病理切片未見明顯異常。見圖1。

2.2各組血清淀粉酶及脂肪酶水平比較AEP組與ANP組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平較對照組均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且ANP組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均高于AEP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組胰腺組織凋亡率比較TUNEL法檢測對小鼠胰腺組織凋亡情況，凋亡細胞的核呈棕黃色，染色質凝聚、濃縮。與對照組相比較，胰腺炎造模小鼠胰腺腺泡細胞凋亡增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AEP組比較，ANP組中TUNEL陽性表達細胞減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

A:CON組；B:AEP組；C：ANP組。

圖1各組小鼠胰腺病理學改變(HE染色，×200)

A:CON組；B:AEP組；C：ANP組。

圖2TUNEL法檢測各組小鼠胰腺腺泡細胞凋亡(DAB染色，×200)

2.4RIP1 mRNA的表達各組小鼠胰腺組織RIP1 mRNA表達水平，見圖3。與對照組(2-△△Ct值為1.00)比較，AEP組胰腺組織RIP mRNA表達水平(2-△△Ct值為1.90)增加；ANP組小鼠胰腺組織RIP mRNA表達(2-△△Ct值為0.30)較AEP組減少。

2.5RIP1蛋白的表達各組胰腺組織RIP蛋白的表達，見圖4。AEP組小鼠胰腺組織RIP蛋白表達較對照組明顯增加；與AEP組比較，ANP組胰腺組織RIP蛋白的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1　　各組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比較

*：P<0.05，與CON組比較；#：P<0.05，與AEP組比較。

*：P<0.01，與CON組比較。

圖3各組小鼠胰腺組織RIP1 mRNA表達

圖4　　各組小鼠胰腺組織RIP1蛋白的表達

3　討　　論

急性胰腺炎臨床病變程度輕重不等，輕者以胰腺水腫為主，臨床多見，病情常呈自限性，預后良好。而重癥患者胰腺病變常表現(xiàn)為出血壞死，臨床經過兇險，死亡風險高。胰腺病理變化的輕重程度和急性胰腺炎的臨床表現(xiàn)密切相關，但是調控胰腺炎癥嚴重程度的具體因素尚不明確。本研究成功建立了水腫型和壞死型兩種急性胰腺炎小鼠模型，探討這兩種不同炎癥程度急性胰腺炎的可能影響因素。

腺泡細胞死亡是急性胰腺炎癥過程中的重要病理特征，因此探討腺泡細胞死亡的機制具有重要意義[4]。研究認為，腺泡細胞的壞死和凋亡共同存在于急性胰腺炎的不同病理類型中。凋亡是受調控的細胞自主的程序性死亡，胰腺腺泡細胞凋亡可保護腺泡細胞損傷，并可減輕胰腺炎癥程度[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，AEP小鼠胰腺腺泡細胞凋亡較ANP小鼠明顯增多，顯示胰腺炎性病變的嚴重度和細胞凋亡呈負相關，誘導胰腺腺泡細胞的凋亡可能在一定程度上減輕胰腺的炎癥程度。

過去細胞壞死被視為不受信號調控的無序過程，而最近的研究證實細胞壞死也存在程序性調控，稱為程序性壞死。RIP是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞的凋亡與存活、程序性壞死等過程中發(fā)揮著關鍵性的作用[6]。RIP1為RIP家族中的第1個成員，其介導的細胞程序性壞死在調控細胞死亡中起重要作用，抑制RIP1可以減輕壞死性細胞死亡，這已經被有關腦出血、肝臟缺血再灌注、小腸缺血等體內和(或)體外的研究所證實[7-8]。有關RIP1在胰腺炎中的作用，以往研究用雨蛙素誘導胰腺炎，RIP水平和細胞壞死程度直接相關。Liu等[9]通過體外實驗也證實RIP1可介導細胞壞死。本研究則是分別用雨蛙素及雨蛙素加脂多糖誘導不同的胰腺炎模型，探討RIP1的表達情況。結果顯示：AEP小鼠胰腺組織中RIP1 mRNA及蛋白表達均較ANP小鼠明顯增加，證實RIP1參與了急性胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展過程。相較于單獨使用雨蛙素，加用脂多糖后，基因水平和蛋白水平都證實RIP1表達明顯降低，說明脂多糖抑制了RIP1的表達。

有關壞死調控蛋白RIP1在胰腺炎中的具體作用機制，目前尚不清楚。Yao等[10]研究證實，RIP1通過調節(jié)死亡受體介導巨噬細胞的自噬和凋亡。在胰腺癌細胞中敲除RIP1后，原本對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)誘導凋亡抵制的細胞變得對TRAIL誘導凋亡異常的敏感，說明RIP1有抑制細胞凋亡的作用[11]。Nikseresht等[12]也證實，抑制RIP1可減輕脂多糖誘導的細胞凋亡。其機制是，抑制RIP1發(fā)揮抗炎效應，且增加了抗氧化活性[12]。結合本研究結果，AEP組小鼠的細胞死亡以凋亡為主，壞死較少，而調控程序性死亡的RIP1卻明顯增加；ANP組小鼠的細胞死亡以壞死為主，凋亡較少，此時RIP1卻明顯減少。造成這種差異的原因目前尚不清楚，筆者推測可能是AEP過程中細胞壞死更多接受程序性調控，而ANP可能以非程序性調控壞死為主。是否RIP1介導的程序性死亡和細胞凋亡通過相互調控而發(fā)揮作用，其具體的機制是后續(xù)研究關注的重點。

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Study on role of RIP1 in apoptosis of pancreatic acinar cell in acute pancreatitis*

ZhouXiangyu，ZhengYingqiang，HeXuemei

(DepartmentofVascularandThyroidSurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the role of apoptosis and the regulating role of receptor interacting protein 1(RIP1) in acute pancreatitis.MethodsThirty C57 mice were divided into three groups: control group,acute edematous pancreatitis (AEP) group and acute necrotizing pancreatitis (ANP) group.The AEP group was continuously injected by cerulein 50 μg/kg for 13 times,the ANP group was continuously injected by cerulein 50 μg/kg for 13 times and lipopolysaccharide 15 mg/kg once; the control group was injected by the same volume of normal saline for 7 times.The acinar cell apoptosis was observed by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling (TUNEL) assay.The RIP1 mRNA expression was measured by real time fluorescence PCR.The expression of RIP1 protein was detected by Western blotting.ResultsThe mouse models of AEP and ANP were established successfully.Compared with the control group,acinar cell apoptosis existed in both AEP and ANP model groups,moreover compared with the AEP group,apoptosis in the ANP group were decreased,the differences were statistically significant(P<0.05).Compared with the control group,the expression of RIP1 mRNA and protein in the AEP group was increased,while which in the ANP group were decreased,the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionRIP1 participate in the pathogenesis of acute pancreatitis,which may associate with acinar cell apoptosis.

acute pancreatitis；edematous pancreatitis；necrotizing pancreatitis；apoptosis；receptor interacting protein

國家自然科學基金資助項目(81100272)；四川省科技廳基金資助項目(2014JY0004)。作者簡介：周翔宇(1977-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事急性胰腺炎發(fā)病機制與免疫相關研究。

R576

A

1671-8348(2016)21-2894-03

2016-01-26

2016-04-13)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.004