高文強, 劉　坤, 周　艷, 劉寒旸, 湯黎明

(南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院 胃腸外科, 江蘇 常州, 213164)

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腺苷對人胃癌MGC-803細胞增殖與凋亡的影響

高文強, 劉坤, 周艷, 劉寒旸, 湯黎明

(南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院 胃腸外科, 江蘇 常州, 213164)

摘要:目的觀察腺苷(adenosine)對人胃癌MGC-803細胞的增殖、凋亡的影響。方法CCK-8法檢測不同濃度腺苷(0.01～10 mmol/L)對胃癌MGC-803細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測腺苷(0.25、0.5、1 mmol/L)對細胞凋亡的影響。Western blot檢測腺苷處理后細胞內凋亡相關蛋白和內質網應激相關蛋白的表達量。結果腺苷能抑制胃癌MGC-803細胞的活力，并且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性(P<0.05)。腺苷(0.25、0.5、1 mmol/L)處理24 h后，細胞的總凋亡率顯著升高(P<0.01)。腺苷可以引起凋亡相關蛋白Caspase-3活化片段的蛋白表達量上調(P<0.01)。腺苷能誘導內質網應激(ERS)相關蛋白Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP、GRP78的表達量上調(P<0.05)。結論腺苷可以抑制胃癌MGC-803細胞的增殖，并且促進凋亡，而內質網應激可能參與了腺苷引起的凋亡。

關鍵詞:胃癌; 腺苷; 增殖; 凋亡; 內質網應激

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)GLOBOCAN 2012的統(tǒng)計，全世界每年新發(fā)胃癌約95.1萬例，其發(fā)病率目前在全球范圍內居第5位，每年因胃癌死亡約72.3萬例，其死亡率在全球范圍內位居第3位[1-2]。在中國，大部分胃癌病例在確診時已是進展期，手術治療難以達到治愈，常常需要配合系統(tǒng)性化療[3]。雖然目前化療藥物種類繁多，但是探索新的抗癌藥物一直是治療腫瘤的研究方向。腺苷是三磷酸腺苷ATP經過內源性核苷酸酶催化的代謝產物[4]。正常情況下，腺苷的濃度維持在極低的水平，可以通過轉運體轉運到細胞內或者直接作用于細胞膜表面的腺苷受體來調節(jié)細胞的生理功能[5]。高濃度的胞外腺苷能誘導肺癌[6]、肝癌[7]、卵巢癌[8]、乳腺癌[9]等多種腫瘤細胞的凋亡。本研究探討腺苷對于胃癌的作用和機制，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1材料

人胃癌MGC-803細胞株(中科院細胞庫)；腺苷(A4036，Sigma公司，美國); CCK-8細胞計數(shù)試劑盒(同仁化學研究所，日本)；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國)；Annexin V PE凋亡檢測試劑盒(Affymetrix公司，美國)；cleaved Caspase-3、Caspase-4、cleaved Caspase-4、JNK、p-JNK、CHOP和GRP78一抗(Cell Signaling公司，美國)；Tubulin一抗、HRP標記的羊抗鼠二抗和HRP標記的羊抗兔二抗(南京諾唯贊公司)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒和ECL顯影試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：MGC-803細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清和1%雙抗，于37℃飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3 d換液，傳代細胞使用0.25%胰酶-EDTA消化液消化2 min。

1.2.2CCK-8試驗檢測細胞活力：取對數(shù)生長期的MGC-803細胞制成混懸液，分別以5×104個/mL細胞密度接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種100 μL混懸液，樣本孔四周用PBS填充。每隔24 h檢測1次，連續(xù)監(jiān)測3 d，每次各組5個孔分別加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)1 h 后使用酶標儀(Molecular Devices 公司，美國)測定波長450 nm處的吸光度值，計算實驗組/對照組吸光度的比值，取百分數(shù)，制作細胞生長曲線，實驗重復3次。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡：加入不同濃度腺苷處理24 h后，收集各組大約1×105個細胞，用PBS溶液洗滌，離心，加入100 μL緩沖液重懸。細胞懸液加入5 μL Annexin VPE，室溫下避光孵育15 min。1×緩沖液洗滌離心1次，加入200 μL緩沖液重懸。細胞懸液加入5 μL 7-AAD, 4 h內流式細胞儀檢測，保持樣品2～8℃且避光。檢測分析早期凋亡(Annexin V PE+, 7-AAD-)和晚期凋亡(Annexin V PE+, 7-AAD+)的所占比率。

1.2.4Western blot：細胞使用RIPA裂解液裂解，45 min后提取總蛋白，BCA法測定蛋白樣品含量，加入上樣緩沖液后100℃加熱5 min。12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離蛋白，濕轉法轉膜至PVDF膜。5% BSA室溫下封閉1 h, 一抗4℃孵育過夜后PBST洗膜3次，計入HRP標記的二抗孵育1 h, PBST洗膜3次。采用ECL試劑盒顯影，凝膠電泳成像系統(tǒng)進行自動攝片分析，蛋白條帶的灰度值由ImageJ軟件進行分析。

2結果

2.1腺苷對MGC-803細胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測腺苷對MGC-803細胞增殖能力的影響。每組含有腺苷的細胞與空白對照組的比值表示細胞的增殖能力。濃度為0.5 mmol/L腺苷處理48 h組的細胞增殖能力比空白對照組顯著降低(P<0.01)。MGC-803細胞的增殖能力隨著腺苷濃度的增加而下降，隨著處理時間的延長而下降，呈濃度和時間依賴性。見圖1。

與對照組(腺苷0mmol/L)比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3

2.2腺苷對MGC-803細胞凋亡的影響

采用流式細胞術檢測腺苷對MGC-803細胞凋亡的影響。結果顯示MGC-803細胞經過腺苷(0.5 mmol/L)處理后的總凋亡率為(30.59±4.1)%，與空白對照組的總凋亡率(4.44±1.4)%相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。相比空白對照組的晚期凋亡率，3組腺苷處理組的晚期凋亡率顯著升高(P<0.01)。腺苷處理組的早期凋亡率與空白對照組相比沒有變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

表1　MGC-803細胞經過腺苷處理后的凋亡率的變化　 %

與對照組(腺苷0 mmol/L)比較, **P<0.01。

圖2 腺苷對MGC-803細胞凋亡的影響

2.3腺苷對MGC-803細胞內Caspase-3活化片段的表達量的影響

采用Western blot檢測細胞內Caspase-3活化片段的表達量變化。結果顯示，在腺苷處理48 h后，濃度為0.25、0.5、1 mmol/L腺苷處理組細胞內的Caspase-3活化片段的蛋白表達量要顯著高于空白對照組(P<0.01)，并且Caspase-3活化片段的蛋白表達量隨著腺苷濃度的增加而升高。在腺苷處理濃度為0.5 mmol/L時，腺苷處理24、48、72 h組細胞內的Caspase-3活化片段的蛋白表達量都顯著高于空白對照組(P<0.01)，并且Caspase-3活化片段的蛋白表達量隨著時間的延長而升高。見圖3。

A: Western blot檢測Caspase-3活化片段的蛋白表達水平;B: 重復檢測樣本的量化數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學處理結果(與對照組相比較, **P<0.01, n=3)

2.4腺苷對內質網應激相關蛋白表達的影響

采用Western blot檢測細胞內Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP和GRP78的蛋白表達量變化。結果顯示，經過濃度為0.25、0.5、1 mmol/L腺苷處理組細胞內的Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP和GRP78的表達量顯著高于各自的空白對照組(P<0.05)。隨著腺苷濃度的升高，細胞內Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP和GRP78的表達量也隨之增加。見圖4。

A: Western blot檢測的Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP、GRP78的蛋白表達水平;B: 重復檢測樣本的量化數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學處理結果(與對照組相比較, **P<0.01, n=3)

3討論

目前，進展期胃癌的術后復發(fā)和預后差等問題依然是綜合治療需要攻克的難關，局部或遠處復發(fā)轉移是導致胃癌無法治愈的主要原因。因此，對進展期胃癌進行局部和全身系統(tǒng)性的化療變得尤為重要。所以在綜合治療模式下，積極探索新型化療藥物和新方案的組合已然是當務之急[10-11]。

本研究觀察到腺苷能抑制胃癌細胞MGC-803的生長，并且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。流式細胞儀檢測到了腺苷處理24 h過后的MHC-803細胞發(fā)生了凋亡。同時還發(fā)現(xiàn)，細胞內的Caspase-3活化片段的蛋白表達量顯著增加。研究結果表明，腺苷能通過激活Caspase-3誘導凋亡，從而抑制胃癌細胞的增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)內質網應激相關蛋白Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP、GRP78的蛋白表達水平顯著上調。

內質網應激反應與細胞的凋亡關系密切，可以經過多種途徑激活凋亡蛋白Caspase-3，進而促進細胞發(fā)生凋亡[12]。在細胞的內質網感受到外界的刺激時，就會引起蛋白的錯誤折疊。為了抵抗蛋白的錯誤折疊，細胞會上調GRP78蛋白來結合未折疊的蛋白，從而減少錯誤折疊的蛋白，這種細胞保護機制叫做未折疊蛋白反應(UPR)[13-14]。隨著外界刺激的持續(xù)，未折疊的蛋白越來越多，細胞的這種保護機制克服不了內質網應激反應時，細胞凋亡就會被激活。在這過程中，未折疊蛋白反應會引起3種蛋白的表達量的上調，即IRE1，PERK和ATF6[15]。作為IRE1，PERK和ATF6的下游蛋白，Caspase-4活化片段、p-JNK和CHOP蛋白的表達量也會被激活上調，最后激活細胞的凋亡蛋白Caspase-3，導致細胞凋亡[16]。

在研究治療腫瘤的過程中，促進其發(fā)生凋亡是一種重要的治療方法[17]。本研究發(fā)現(xiàn)腺苷能通過誘導凋亡來抑制胃癌細胞的增殖，而內質網應激可能參與了腺苷誘導的凋亡。細胞凋亡的機制是復雜的，腺苷作用于胃癌細胞的機制還需要繼續(xù)進一步研究。

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收稿日期:2015-12-16

中圖分類號:R 735.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)13-044-04

DOI:10.7619/jcmp.201613013

Effects of adenosine on proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell line MGC-803

GAO Wenqiang, LIU Kun, ZHOU Yan, LIU Hanyang, TANG Liming

(1.DepartmentofGastrointestinalSurgery,ChangzhouSecondPeople′sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of adenosine on proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell line MGC-803.MethodsMGC-803 cells were treated with different concentrations of adenosine (0.01～10 mmol/L), and CCK-8 was used to observe cell proliferation.Flow cytometry (FCM) was used to analyze cells apoptosis after treatment of adenosine.Apoptosis protein Caspase-3 and endoplasmic reticulum stress (ERS) related proteins (casepase-4, p-JNK, CHOP, GRP78) were detected by Western blotting.ResultsAdenosine significantly inhibited the MGC-803 cells viability in a concentration- and time-dependent manner (P<0.05).After treatment with adenosine (0.25, 0.5, 1 mmol/L) for 24 h, total apoptosis rate of cells significantly increased (P<0.01).Expression of cleaved Caspase-3 was significantly up-regulated after treatment with adenosine (P<0.01).ERS related proteins (casepase-4, p-JNK, CHOP, GRP78) were significantly up-regulated in adenosine treated group (P<0.05).ConclusionAdenosine can significantly suppress proliferation and induce apoptosis in MGC-803 cells, while endoplasmic reticulum stress is involved in adenosine-induced apoptosis.

KEYWORDS:gastric carcinoma; adenosine; proliferation; apoptosis; endoplasmic reticulum stress