劉博+許巖+馬娜+廖文輝+汪勝+林啟康+梁偉健+孟金蘭

[摘要] 目的 探討硫化氫（H2S）是否通過改變葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達參與其對抗6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)PC12細胞損傷的保護作用。 方法 應(yīng)用具有神經(jīng)毒性的6-OHDA損傷PC12細胞為帕金森病細胞模型，以硫氫化鈉（NaHS）作為H2S的供體；應(yīng)用CCK-8比色法檢測細胞存活率；DFCH-DA染色檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平；Rh123染色檢測細胞線粒體膜電位（MMP）；Western blot檢測GRP78的表達。 結(jié)果 200 μmol/L的6-OHDA引起PC12細胞的存活率顯著降低，ROS生成增加及MMP降低，且誘導(dǎo)了GRP78的高表達。應(yīng)用25～400 μmol/L的NaHS預(yù)處理30 min，呈濃度依賴性抑制6-OHDA引起的細胞存活率降低，其中400 μmol/L的NaHS作用最明顯，此濃度也可以顯著減少6-OHDA引起的ROS增多，提高MMP，同時明顯抑制6-OHDA誘導(dǎo)的GRP78高表達。 結(jié)論 H2S具有抗6-OHDA氧化應(yīng)激損傷的PC12細胞保護作用，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78的表達可能是其機制之一。

[關(guān)鍵詞] 硫化氫；帕金森病；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；GRP78；PC12細胞

[中圖分類號] R741 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）09（b）-0004-05

Hydrogen sulfide attenuates 6-OHDA-induced injury by inhibition of the GRP78 pathway in PC12 cells

LIU Bo1 XU Yan2 MA Na3 LIAO Wen-hui1 WANG Sheng3 LIN Qi-kang1 LIANG Wei-jian1 MENG Jin-lan3▲

1.Class 1 of Pharmaceutical Preparations 2011，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China；2.Department of the Third Surgery，Cancer Center of Southern Medical University TCM-Integrated Hospital，Guangzhou 510315，China；3.Department of Physiology，School of Basic Courses Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China

[Abstract] Objective To investigate whether hydrogen sulfide（H2S）involved in the protection of PC12 cells against 6-hydroxydopamine（6-OHDA）-induced injury by changing the glucose-regulated protein 78（GRP78）expression. Methods 6-OHDA was used to establish the Parkinson disease model in PC12 cells with dopaminergic neurons characteristics.Sodium hydrosulfide（NaHS）was used as a H2S donor.The viability of PC12 cells was measured by CCK-8 assay.The level of reactive oxygen species（ROS）in PC12 cells was measured by DCFH-DA staining.The mitochondrial membrane potential（MMP）was analyzed by rhodamine 123 staining.The expression of GRP78 was evaluated by Western blot. Results 200 μmol/L 6-OHDA induced a decrease in cell viability and overproduction of ROS as well as dissipation of MMP in PC12 cells.6-OHDA induced the upregulation of GRP78 expression.When PC12 cells were treated with NaHS 30 min before 6-OHDA treatment a decrease in viability of PC12 cells induced by 6-OHDA was concentration-dependently blocked by NaHS（25-400 μmol/L）.Pretreatment with NaHS at 400 μmol/L obviously inhibited the dissipation of MMP and overproduction of ROS induced by 200 μmol/L 6-OHDA.Furthermore，NaHS preconditioning obviously dicreased the upregulation of GRP78 expression induced by 6-OHDA. Conclusion H2S protected PC12 cells against 6-OHDA-induced oxidative stress injury and inhibiting the expression of GRP78 may be one of the mechanism underlying cytoprotection induced by H2S preconditioning.

[Key words] Hydrogen sulfide；Parkinson disease；Endoplasmic reticulum stress；Glucose-regulated protein 78；PC12 cells

帕金森病（Parkinson disease，PD）是老年人中患病率和致殘率較高的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一。目前PD的病因尚不清楚，但活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過量引起的氧化應(yīng)激參與了PD的發(fā)病機制[1]；研究也表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡是PD發(fā)生的重要病理生理機制之一[2-3]。近年來，H2S在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的研究日益深入，生理含量的H2S不僅具有神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用[4]，而且被視為一種重要的生理性保護成分調(diào)節(jié)多種重要的生理功能。研究已闡明H2S參與腦內(nèi)氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和細胞凋亡的調(diào)節(jié)[5]，可能與PD等神經(jīng)退行性疾病的病理機制有關(guān)。已有研究表明，H2S可以通過抑制ERS發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的心肌保護作用，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中H2S與ERS之間的關(guān)系目前知之甚少。H2S能否通過抑制ERS保護神經(jīng)細胞對抗氧化應(yīng)激損傷尚未明確。本研究應(yīng)用神經(jīng)毒性藥物6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)PC12細胞為PD細胞模型，觀察H2S預(yù)處理對抗6-OHDA氧化應(yīng)激損傷的PC12細胞保護作用及對ERS信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

NaHS、6-OHDA、維生素C購自Sigma公司；CCK-8、DCFH-DA、Rh123購自壁云天生物公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibico BRL公司（NY USA）；GAPDH購自Boster Bio-engineering公司；GRP78抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

PC12細胞在37℃、5% CO2條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后每2～3天傳代1次。藥物處理在細胞對數(shù)生長期進行。

1.3 實驗分組

1.3.1 探討NaHS預(yù)處理對抗6-OHDA誘導(dǎo)的細胞毒性作用 實驗分為9組：空白對照組；NaHS對照組（單獨應(yīng)用400 μmol/L的NaHS預(yù)處理PC12細胞30 min）；根據(jù)NaHS干預(yù)濃度（0，25，50，100，200，400，800 μmol/L）+6-OHDA將PC12細胞依次分為7組（6-OHDA損傷組及NaHS干預(yù)1、2、3、4、5、6組），每組應(yīng)用不同濃度NaHS干預(yù)30 min，再應(yīng)用200 μmol/L的6-OHDA處理PC12細胞24 h，觀察NaHS預(yù)處理對抗6-OHDA細胞毒性的保護作用。

1.3.2 探討NaHS預(yù)處理對抗6-OHDA誘導(dǎo)ROS生成、線粒體膜電位降低及對GRP78表達的影響 實驗分4組：空白對照組；6-OHDA損傷組（200 μmol/L的6-OHDA處理PC12細胞4 h或24 h）；NaHS預(yù)處理組：400 μmol/L的NaHS預(yù)處理30 min后再應(yīng)用200 μmol/L的6-OHDA處理PC12細胞相應(yīng)時間；NaHS對照組：單獨應(yīng)用400 μmol/L的NaHS預(yù)處理30 min。

1.4 CCK-8法檢測細胞存活率

以1×104/孔的密度將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組包括4個復(fù)孔。顯微鏡下觀察細胞生長至70%～80%融合時，給予不同因素處理，每孔加入CCK-8工作液150 μl（無血清培養(yǎng)基稀釋），并設(shè)定空白對照組。37°C孵育3 h，每孔吸光度值用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測得。按細胞存活率（%）=（OD處理組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100來計算4孔光密度的平均值，即為每組細胞的存活率。

1.5 ROS含量的檢測

PC12細胞接種于24孔板內(nèi)，給予不同因素處理后用DMEM培養(yǎng)液（不加血清）洗滌2次，加入終濃度為1 μmol/L的2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DFCH-DA），37℃避光孵育30 min，熒光顯微鏡下攝片。用ImageJ 1.41分析軟件選取5個不同的視野進行平均熒光強度統(tǒng)計分析。

1.6 細胞內(nèi)線粒體膜電位（mitochondria membrane potential，MMP）的檢測

PC12細胞接種于24孔板內(nèi)，給予不同因素處理后用PBS洗滌2次，加入100 μg/L的Rh123，37℃避光孵育45 min，熒光顯微鏡下攝片。用ImageJ 1.41分析軟件選取5個不同的視野進行平均熒光強度統(tǒng)計分析。

1.7 Western blot檢測蛋白的表達

細胞接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，各處理因素結(jié)束后，收集細胞并用細胞裂解液50 μl在冰上裂解。4℃ 12 000×g離心細胞裂解物5 min，上清-80℃保存。用BCA蛋白定量試劑盒將提取的蛋白樣品進行蛋白定量。將相同蛋白量的各組樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳。待蛋白質(zhì)分離后，100 V真空電轉(zhuǎn)移1 h轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下PVDF膜用含5% PBST溶解的脫脂奶粉封閉1 h。4℃孵育一抗GRP78（1∶1000）過夜，室溫PBS洗脫3次，室溫繼續(xù)孵育相應(yīng)二抗1 h，PBST洗脫1 h，中間換液3次。免疫信號用增強型化學(xué)發(fā)光法顯色，以曝光到X線膠片上。將X線膠片掃描后，用ImageJ 1.41分析軟件進行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaHS保護PC12細胞對抗6-OHDA細胞毒性的作用

NaHS在一定濃度范圍內(nèi)（25～400 μmol/L）可呈劑量依賴性抑制200 μmol/L的6-OHDA誘導(dǎo)的細胞毒性，其中400 μmol/L的NaHS保護作用最佳，但其本身不影響PC12細胞的存活率，隨著NaHS濃度的增加，NaHS保護作用減弱（圖1）。

圖1 NaHS保護PC12細胞對抗6-OHDA細胞毒性的作用

與空白對照組比較，*P<0.01；與6-OHDA損傷組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 NaHS保護PC12細胞拮抗6-OHDA誘導(dǎo)的ROS生成增多

細胞內(nèi)ROS變化可通過DCF的熒光強度來反映，當(dāng)細胞經(jīng)6-OHDA處理4 h后，與空白對照組相比，6-OHDA損傷組細胞內(nèi)ROS的生成明顯增加；經(jīng)NaHS預(yù)處理后，PC12細胞內(nèi)ROS的生成明顯受到抑制，提示NaHS能保護PC12細胞拮抗6-OHDA誘導(dǎo)的ROS生成增多；NaHS本身不影響細胞內(nèi)ROS的生成（圖2）。

圖2 NaHS保護PC12細胞拮抗6-OHDA誘導(dǎo)的ROS生成增多

與空白對照組比較，*P<0.01；與6-OHDA損傷組比較，#P<0.01

2.3 NaHS保護PC12細胞拮抗6-OHDA誘導(dǎo)的MMP降低

細胞內(nèi)MMP變化可以通過Rh123的熒光強度來判斷，當(dāng)細胞經(jīng)6-OHDA處理24 h后，與空白對照組相比，6-OHDA損傷組細胞內(nèi)MMP明顯受到抑制；經(jīng)NaHS預(yù)處理后，PC12細胞內(nèi)Rh123的熒光強度明顯增加，提示NaHS能保護PC12細胞拮抗6-OHDA誘導(dǎo)的MMP降低；NaHS本身不影響細胞內(nèi)MMP的水平（圖3）。

圖3 NaHS保護PC12細胞拮抗6-OHDA誘導(dǎo)的MMP降低

與空白對照組比較，*P<0.01；與6-OHDA損傷組比較，#P<0.01

2.4 NaHS預(yù)處理對6-OHDA誘導(dǎo)GRP78蛋白表達的影響

Western blot顯示，6-OHDA處理PC12細胞24 h后GRP78蛋白表達明顯升高（P<0.01），在6-OHDA干預(yù)前30 min加入400 μmol/L的NaHS預(yù)處理，結(jié)果顯示NaHS顯著降低6-OHDA引起的GRP78高表達（P<0.01），而NaHS本身不影響GRP78的表達，提示NaHS可通過抑制6-OHDA誘導(dǎo)的ERS發(fā)揮細胞保護作用（圖4）。

圖4 NaHS預(yù)處理抑制6-OHDA誘導(dǎo)的GRP78高表達

與空白對照組比較，*P<0.01；與6-OHDA損傷組比較，#P<0.01

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，H2S作為一種新穎的神經(jīng)調(diào)質(zhì)參與調(diào)制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理及病理功能[4-7]，具有神經(jīng)保護作用，能保護星形膠質(zhì)細胞對抗氧化應(yīng)激引起的損傷[8]，能抗脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)[9]，能保護人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y對抗魚藤酮誘導(dǎo)的凋亡等[10]。為了探討H2S對抗6-OHDA誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護作用，本文觀察了6-OHDA對PC12細胞的作用，發(fā)現(xiàn)200 μmol/L的6-OHDA作用24 h可顯著降低PC12細胞的存活率，明顯增加ROS生成及降低細胞的MMP，提示6-OHDA可通過增加ROS及降低MMP損傷多巴胺能神經(jīng)細胞。Kwon等[11]報道，6-OHDA能引起ROS生成增加及降低MMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡，支持本實驗結(jié)果。研究已證實過多的ROS可損傷核酸、蛋白質(zhì)和膜磷脂等重要細胞成分，也可降低MMP，從而導(dǎo)致細胞損傷，支持本實驗結(jié)果。本文進一步觀察發(fā)現(xiàn)NaHS能通過提高PC12細胞的MMP及抑制ROS生成，增加細胞存活率發(fā)揮對抗6-OHDA引起的細胞毒性作用，結(jié)果提示外源性H2S能對抗6-OHDA引起的PC12細胞氧化應(yīng)激損傷，具有神經(jīng)細胞保護作用，可能與其抑制ROS生成增多和改善MMP有關(guān)。

多種原因如缺氧、饑餓、鈣離子平衡失調(diào)、自由基侵襲及藥物等可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)錯誤折疊或未折疊，這些蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累引起ERS[12-14]。GRP78是ERS的標(biāo)志性分子，其表達變化與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[15-16]。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)，6-OHDA處理PC12細胞24 h誘導(dǎo)了GRP78高表達，提示6-OHDA造成的PC12細胞損傷作用與其誘導(dǎo)ERS有密切關(guān)系。Omura等[2]研究表明，ERS介導(dǎo)了神經(jīng)退行性疾病如PD的神經(jīng)元凋亡，支持本實驗結(jié)果。

相關(guān)研究指出，外源性H2S可抑制同型半胱氨酸在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)的ERS分子GRP78的表達，顯著減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，加速過氧化氫的清除而保護心肌[17]，提示H2S的器官或細胞保護作用與抑制GRP78信號途徑有關(guān)，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對H2S與GRP78關(guān)系的研究目前知之甚少。H2S預(yù)處理抗6-OHDA損傷的PC12細胞保護作用是否與抑制GRP78信號通路有關(guān)未見報道。本實驗觀察顯示，應(yīng)用400 μmol/L的NaHS預(yù)處理30 min明顯抑制6-OHDA誘導(dǎo)的GRP78高表達，提示H2S預(yù)處理可通過下調(diào)GRP78的表達發(fā)揮對抗6-OHDA損傷的PC12細胞保護作用。關(guān)于兩者關(guān)系還需進一步深入研究。

綜上所述，6-OHDA通過增加ROS、降低MMP引起PC12細胞氧化應(yīng)激損傷，引起ERS標(biāo)志性分子GRP78的高表達；H2S具有對抗6-OHDA氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)細胞保護作用，抑制GRP78表達上調(diào)可能是其機制之一。

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（收稿日期：2014-07-14 本文編輯：李亞聰）

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（收稿日期：2014-07-14 本文編輯：李亞聰）

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（收稿日期：2014-07-14 本文編輯：李亞聰）