劉　琴　王麗平　陳　芳　陳利鋒　張　宜

(解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢430070)

?

懸浮組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞

劉琴王麗平陳芳陳利鋒①張宜

(解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢430070)

[摘要]目的：建立兔成纖維樣滑膜細(xì)胞懸浮組織塊分離培養(yǎng)法。方法：取正常兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用懸浮組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長狀況及形態(tài)特征，取第3代對(duì)數(shù)期細(xì)胞，CCK-8法繪制其生長曲線，免疫熒光法檢測(cè)波形蛋白的表達(dá)情況，并與組織塊貼壁法進(jìn)行比較。結(jié)果：兩種方法體外培養(yǎng)得到的兔成纖維樣滑膜細(xì)胞形態(tài)為長梭形纖維樣，細(xì)胞生長力較旺盛，生長曲線為典型的“S”形，免疫熒光檢測(cè)顯示第3代細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)波形蛋白。結(jié)論：懸浮組織塊法可以分離培養(yǎng)出兔成纖樣維滑膜細(xì)胞，方法簡便，效率高，為體外分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞提供了一種新的方法。

[關(guān)鍵詞]懸浮組織塊法；兔成纖維樣滑膜細(xì)胞；分離；培養(yǎng)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎為主要特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，嚴(yán)重危害著人類健康。滑膜過度增生、增厚是造成關(guān)節(jié)損傷的主要病理基礎(chǔ)之一。成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLSs)為滑膜中最主要的細(xì)胞，它參與滑膜增生和組織蛋白酶的分泌，與RA晚期關(guān)節(jié)損傷有著密切的關(guān)系[1,2]。因此，F(xiàn)LS的體外培養(yǎng)是探尋RA發(fā)病機(jī)制與體外篩選藥物的重要手段。成纖維樣滑膜細(xì)胞分離培養(yǎng)主要方法之一為組織塊貼壁法，但存在一定的缺點(diǎn)，如組織塊不易貼壁、操作時(shí)間長、細(xì)胞活性較差等[3,4]。本文采用懸浮組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞，并與組織塊貼壁法作比較。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康新西蘭大白兔4只，雄性，體質(zhì)量1.0 kg，由武漢市新洲區(qū)萬千佳禾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0011，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SCXK(鄂)2014-0082。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS(Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青鏈霉素雙抗、胰酶、CCK-8(碧云天)；小鼠波形蛋白(Vimentin)抗體、熒光(Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG)(武漢博士德生物工程有限公司)；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO儀器MCO-175)；生物安全柜(海爾)。

1.2方法

1.2.1組織塊懸浮法新西蘭大白兔2只，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸濕膝關(guān)節(jié)，去皮，1%碘伏與75%酒精依次消毒，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，找出關(guān)節(jié)囊，用手術(shù)剪分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出平滑光亮的滑膜層組織，將滑膜組織放入含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS中。移入超凈臺(tái)中，用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS洗3次，剪成1～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿3～4塊滑膜組織塊，加入2～3 ml含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液使其處于懸浮狀態(tài)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長形態(tài)并照相。4～5 d后進(jìn)行首次換液，12～14 d后細(xì)胞達(dá)到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶進(jìn)行1∶2傳代。

1.2.2組織塊貼壁法新西蘭大白兔2只，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸濕膝關(guān)節(jié)，去皮，1%碘伏與75%酒精依次消毒，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，找出關(guān)節(jié)囊，用手術(shù)剪分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出平滑光亮的滑膜層組織，將滑膜組織放入含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS中。移入超凈臺(tái)中，用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS洗3次，用滅菌的濾紙吸干殘留在組織表面的水分，剪成1～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿7～8塊滑膜組織塊，平皿于溫箱內(nèi)倒置0.5～1 h后輕輕地加入3～4 ml含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3～4 d后進(jìn)行首次換液。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長形態(tài)并照相。12～14 d后細(xì)胞達(dá)到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶進(jìn)行1∶2 傳代。

1.2.3細(xì)胞鑒定取第3代細(xì)胞，按1×105/孔接種入含有爬片的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定液于4℃固定30 min。PBS洗3次，0.5%Triton X-100室溫通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，滴加足夠量的Vimentin一抗(1∶100稀釋)并放入濕盒，4℃孵育過夜。PBS洗3次，吸水紙吸干爬片上多余液體，滴加稀釋好的熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶100稀釋)，濕盒中20～37℃孵育1 h，PBS洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.4細(xì)胞生長曲線的測(cè)定取第3代細(xì)胞，按1×103/孔接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后隨機(jī)取出一組，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察組織塊懸浮法和貼壁法接種3～4 d后，在光鏡下可見少量細(xì)胞生長，形態(tài)多為長梭形，少數(shù)為圓形、多角形。6～7 d后，在光鏡下可見大量細(xì)胞生長，形態(tài)仍以長梭形為主，少見多角形、圓形。8～9 d去除組織塊。13～15 d，細(xì)胞數(shù)量增多，達(dá)到90%融合，形態(tài)為以典型的長梭形為主。初步判斷為兔成纖維樣滑膜細(xì)胞。培養(yǎng)出來的細(xì)胞6～7 d可傳代一次，傳代后大部分細(xì)胞4～7 h貼壁，12～24 h開始生長。傳至P3時(shí)，可見大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞均勻分布。傳至5～6代時(shí)，細(xì)胞活性明顯下降。兩種方法所得到的細(xì)胞生長過程和細(xì)胞形態(tài)如圖1。

2.2細(xì)胞生長曲線用CCK-8法檢測(cè)兩種方法分離培養(yǎng)得到的第3代兔成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示：培養(yǎng)出來的細(xì)胞增殖能力均較強(qiáng)，經(jīng)過2 d潛伏期后在第4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增殖，第7天進(jìn)入平臺(tái)期，繪制出來的細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)典型的“S”形，見圖2。

圖1　原代兔成纖維樣滑膜細(xì)胞培養(yǎng) (×100)Fig.1　Primary culture of rabbit fibroblast-like synovio-cytes(×100)Note: Suspended explant culture method A-D:A.Primary culture for 3-4 days;B.Primary culture for 6-7 days;C.Primary culture for 13-15 days;D.The third passage cells.Explants adherent culture method E-H: E.Primary culture for 3-4 days;F.Primary culture for 6-7 days;G.Primary culture for 13-15 days;H.The third passage cells.

圖2　兔成纖維樣滑膜細(xì)胞生長曲線Fig.2　Growth curve of rabbit fibroblast-like synoviocytes

圖3　免疫熒光檢測(cè)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞胞漿中波形蛋白表達(dá)情況Fig.3　Expression of vimentin in rabbit fibroblast-like synoviocytes by immunofluorescence staining

2.3免疫熒光觀察免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種方法分離得到的細(xì)胞中胚層組織特征性波形蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性(圖3)。

3討論

目前，成纖維樣滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)主要方法之一為組織塊貼壁法，在操作上存在一定的缺陷。此法的重點(diǎn)是確?；そM織塊能夠牢固貼壁，但在實(shí)際操作中很難保證每塊組織塊都貼壁，尤其是在換液過程中，組織塊很容易脫落，造成滑膜組織的浪費(fèi)[5]。為使滑膜組織塊貼壁更加牢固，常需要在加入培養(yǎng)液前將種植有滑膜組織塊的培養(yǎng)瓶/皿在溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)1～3 h，有的甚至過夜，耗時(shí)較長[6-8]。另一方面，需要人為地將組織塊均勻種植在培養(yǎng)瓶瓶/皿中，增加操作時(shí)間[9]。

本實(shí)驗(yàn)采用懸浮組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞，并與組織塊貼壁法進(jìn)行比較。從新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)中分離得到滑膜組織，剪成1～5 mm3大小，加入DMEM-H+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，使組織塊處于懸浮狀態(tài)或貼壁狀態(tài)，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，3～4 d后，在光鏡下可見細(xì)胞生長，形態(tài)多為典型的長梭形，偶見多角形和圓形。13～15 d即可達(dá)到90%融合，細(xì)胞形態(tài)以典型的長梭形為主。傳代后，可見大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞均勻分布。CCK-8法檢測(cè)顯示兩種方法培養(yǎng)出來的第3代兔成纖維樣滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“S”形，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。傳至5～6代時(shí)，細(xì)胞趨于老化，7～8代之后幾乎完全喪失增殖活性，建議采用3～4代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。兩種方法所得到的兔成纖維樣滑膜細(xì)胞生長過程和細(xì)胞形態(tài)學(xué)很相似，并無明顯區(qū)別。

對(duì)于成纖維樣滑膜細(xì)胞的特異分子標(biāo)志目前尚無統(tǒng)一的定論，但有些學(xué)者認(rèn)為成纖維樣滑膜細(xì)胞表面存在尿二苷磷酸葡萄糖脫氫酶(Uridine diphosphoglucose dehydrogenase,UDPGD)、Cadherin -11(Cadherin-11)、CD14、CD44、促衰變因子(Decay accelerating factor,DAF/CD55/mAb67)、Thy-1/CD90、血管細(xì)胞黏附因子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1/CD106)、波形蛋白等[11-13]。實(shí)驗(yàn)選用最常用的成纖維樣滑膜細(xì)胞鑒定蛋白Vimentin。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示兩種方法得到的P3兔成纖維滑膜細(xì)胞表達(dá)Vimentin，與袁琴等[14]人報(bào)道的相符?；ぜ?xì)胞包括巨噬樣滑膜細(xì)胞、成纖維樣滑膜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，其中主要為成纖維樣滑膜細(xì)胞[15]。原代培養(yǎng)細(xì)胞多利用自然純化法獲得較高純度的細(xì)胞，即利用成纖維樣滑膜細(xì)胞可以貼壁生長、貼壁能力較強(qiáng)、增殖速度較快的特性，通過優(yōu)勢(shì)生長、多次消化傳代來去除非成纖維型細(xì)胞和不健康的成纖維樣細(xì)胞，從而獲得較高純度的成纖維樣滑膜細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vimentin表達(dá)強(qiáng)陽性，與其他研究者分離培養(yǎng)得到的成纖維樣滑膜細(xì)胞Vimentin表達(dá)強(qiáng)陽性相符[16，17]，說明通過多次傳代可以得到高純度的兔成纖維樣滑膜細(xì)胞。

該實(shí)驗(yàn)采用懸浮組織塊法成功分離培養(yǎng)出兔成纖維樣滑膜細(xì)胞，與傳統(tǒng)的組織塊貼壁法相比，懸浮中組織塊法具有一定的優(yōu)勢(shì)：①操作非常簡單，處理時(shí)間短，污染機(jī)會(huì)較少，可在一定程度上克服原代培養(yǎng)較常出現(xiàn)的細(xì)菌或真菌污染問題；②此法的核心是將組織塊懸浮起來，可以解決組織塊貼壁法中組織塊貼壁不牢固的問題；③提高珍貴的滑膜組織的利用率。但是在采用懸浮組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維滑膜細(xì)胞的過程中也有一些注意事項(xiàng)：①取材必須保證無菌操作，取材后立即進(jìn)行培養(yǎng)；②滑膜組織塊的接種量是采用懸浮法成功培養(yǎng)出兔成纖維滑膜細(xì)胞的關(guān)鍵，如一個(gè)3.5 cm培養(yǎng)皿加入3～4塊剪碎的組織塊即可；③為區(qū)別于組織塊貼壁法，一定要在培養(yǎng)皿中加入足夠量的培養(yǎng)液使滑膜組織塊處于懸浮狀態(tài)中。

參考文獻(xiàn)：

[1]Turner JD,Filer A.The role of the synovial fibroblast in rheumatoid arthritis pathogenesis[J].Curr Opin Rheumatol,2015,27(2):175-182.

[2]Miyabe Y,Miyabe C,Iwai Y,etal.Activation of fibroblast-like synoviocytes derived from rheumatoid arthritis via lysophosphatidic acid-lysophosphatidic acid receptor 1 cascade[J].Arthritis Res Ther,2014,16(5):461.

[3]Lee H,Kang SW,Byun HS,etal.Brazilin limits inflammatory responses through induction of prosurvival autophagy in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes[J].PLoS One,2015,10(8):e0136122.

[4]繆成貴，周國梁，秦梅頌，等.白頭翁皂抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,40(2):144-149.

[5]Warnock JJ,Fox DB,Stoker AM,etal.Culture of equine fibroblast-like synoviocytes on synthetic tissue scaffolds towards meniscal tissue engineering:a preliminary cell-seeding study[J].Peerj,2014,2:e353.

[6]黃憲章,王前,鄭磊,等.人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,29(3):462-465.

[7]毛偉,李培鋒,劉明強(qiáng),等.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011 ,32(3):78-82.

[8]張曉明,陳飛虎,黃學(xué)應(yīng),等.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定[J].解剖學(xué)雜志,2007,30(6):770-773.

[9]孫貴才，徐軼爾，謝晶日,等.四種不同處理方法體外培養(yǎng)大鼠滑膜細(xì)胞[J].中國組織工程研究,2012,16(7):1193-1196.

[10]秦蘇萍,孫德旭,李慧,等.CIA 大鼠滑膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J].免疫學(xué)雜志,2014,30(12):1096-1099.

[11]蔡文虹,孫保東,張寶鳳,等.兩種方法分離培養(yǎng)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的比較[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(21):13-19.

[12]Zong M,Lu T,Fan S,etal.Glucose-6-phosphate isomerase promotes the proliferation and inhibits the apoptosis in fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther,2015,17(1):100.

[13]肖楚吟,潘云峰,郭興華,等.滑膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及生物特性[J].中國醫(yī)學(xué)工程,2010,18(2):1-4.

[14]袁琴,闞衛(wèi)兵,宋朋飛,等.大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)展,2012,12(2):253-290.

[15]蔣明,朱立平,林孝義.風(fēng)濕病學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,1995:774-775.

[16]丁娟,王志軍,董曉薇,等.RA滑膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,12(36):7008-7011.

[17]黃世峰,肖長虹,顧為望,等.兔關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(11):1045-1047.

[收稿2015-12-03修回2016-01-11]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.017

作者簡介：劉琴(1986年-)，女，碩士，技師，主要從事細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究，E-mail:liuqin_0629@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：張宜(1965年-)，男，碩士，主任藥師，主要從事藥學(xué)信息方面研究，E-mail:abcd1566@sina.com。

中圖分類號(hào)R392.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-1009-04

Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes using suspended explant culture method

LIU Qin,WANG Li-Ping,CHEN Fang,CHEN Li-Feng,ZHANG Yi.

Department of Medical Experiments,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China

[Abstract]Objective:To isolate rabbit fibroblast-like synoviocytes(FLSs) by suspended explant culture method.Methods: The healthy rabbit joint synovial layers were obtained.The cells were cultured by suspended explant culture method and compared with the explants adherent culture method.The growth status and morphology were observed.The growth curve of the 3rd passage cells was measured by CCK-8 assay,and the expression of vimentin was tested by immunocytochemistry.Results: The FLS obtained by the two methods exhibited a spindle-shaped appearance and could rapidly expand.The cell growth curve was typical of S type,and the cells highly expressed vimentin.Conclusion: Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes by suspended explant culture method were successfully established.The method was simple and highly efficient.It provided a new method for the isolation of FLS in vitro.

[Key words]Suspended explant culture method;Rabbit fibroblast-like synoviocytes;Isolation;Culture

①解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢430070。