方 瑩 張小平 鄔萬新

胃癌細胞miR-100表達及對靶基因ZBTB7A的調控作用

方 瑩 張小平 鄔萬新

目的探討胃癌細胞miR-100表達及其對ZBTB7A基因的調控作用。方法使用人胃癌細胞株SGC-7901（低分化、轉移）和BGC-823（低分化），將實驗細胞分為SGC-7901miR-100組、SGC-7901miR-100抑制劑組、SGC-7901Si-陰性對照組、SGC-7901Si-ZBTB7A組、BGC-823 miR-100組、BGC-823 miR-100抑制劑組、BGC-823 Si-陰性對照組及BGC-823 Si-ZBTB7A組。定量PCR法檢測各組miR-100及ZBTB7A mRNA的表達，免疫印跡法檢測ZBTB7A蛋白表達水平，細胞遷移與體外侵襲實驗測定體外細胞遷移和侵襲能力，通過質粒構建及雙熒光素酶報告基因檢測ZBTB7A 3′UTR載體相關的熒光素酶的活性情況。結果熒光素酶報告基因檢測顯示，在miR-100過度表達的SGC7901和BGC823細胞中，與熒光素酶活性相關的ZBTB7A 3′UTR載體顯著減少，分別為（46.4±1.9）%和（55.7±2.3）%；miR-100被敲除時，ZBTB7A 3′UTR載體相關的熒光素酶的活性上調，分別為（32.7±1.9）%和（25.4±3.3）%。蛋白免疫印跡法顯示，過表達的miR-100導致SGC7901和BGC823細胞中ZBTB7A表達的蛋白水平分別降低（81.8±3.8）%和（62.9± 1.3）%；當miR-100被敲除時，ZBTB7A的蛋白水平分別上調（38.1±2.7）%和（46.5±3.4）%。結論ZBTB7A是miR-100的靶基因，miR-100表達可以下調ZBTB7A的表達，從而抑制胃癌細胞的轉移和生長。

胃癌；miR-100；ZBTB7A

胃癌是一個重大的世界性的公共衛(wèi)生問題，是癌癥相關致死的第二大常見原因[1]，當前對miRNA的研究給胃癌的治療提供了新的策略和方向。miR-100是一種非編碼、由20～25核苷酸組成的RNA，屬于MicroRNAs（miRNAs）的一種，常在人類癌癥中出現異常表達，ZBTB7A是一個腫瘤抑制基因，而在胃癌中，ZBTB7A基因是否是miR-100的靶點，以及對胃癌的轉移和侵襲的聯系仍然未知，本文以此為出發(fā)點，探究胃癌中miR-100的異常表達對ZBTB7A基因的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞系使用人胃癌細胞株SGC-7901（低分化、轉移）和BGC-823（低分化）。購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（馬納薩斯，VA，美國）以及上海癌癥研究所（上海，中國）。所有細胞系均在37℃，適宜濕度，和5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，于RPMI 1640培養(yǎng)液中，添加10%的胎牛血清（FBS）。

1.2 試劑和藥品Trizol試劑（Takara公司）,一抗兔體ZBTB7A（1：1000，劍橋，英國），一抗小鼠抗β-Actin（1：1000）。預染標準分子量蛋白marker（Fermentas）。雙熒光素酶載體pmirGLO，內切酶XbaI、SacI，T4 DNA連接酶，感受態(tài)細菌DHS a（Transgen），雙熒光素酶檢測試劑盒（Promega），Pre-miR-100，Negative Control，si-ZBTB7A，Anti-miR-100 inhibitor，X-treme GENE transfection reagent（Roche）。

2 實驗方法

2.1 細胞分組及轉染將SGC-7901細胞系和BGC-823細胞系分為8組，即SGC-7901miR-100組；SGC-7901miR-100抑制劑組；SGC-7901Si-陰性對照組（SCC-7901-空質粒轉染組）；SGC-7901Si-ZBTB7A組；BGC-823 miR-100組；BGC-823 miR-100抑制劑組；BGC-823 Si-陰性對照組（BGC-823-空質粒轉染組）；BGC-823 Si-ZBTB7A組。分別對每組細胞進行轉染[2]，轉染步驟按Roche公司GENE transfection reagent試劑盒說明書進行。將BGC823和SGC7901細胞消化接種于12孔板，每孔接種1× 105個細胞,待其貼壁后轉染，于2個EP管中，1個EP管加入47μL無血清培養(yǎng)基和3μL相對應的轉染質粒，另一個EP管加入48μL無血清培養(yǎng)基和2μLX-treme GENE轉染試劑，將兩個EP管混合并孵育15min，將轉染試劑添加到12孔板內，培養(yǎng)箱孵育72h之內通過熒光顯微鏡觀察并驗證其轉染效率,每組轉染效率大于70%的樣本即可滿足后續(xù)實驗要求。

2.2 定量PCR按Trizol試劑盒的說明進行定量聚合酶鏈反應（PCR）[3]，對處于對數生長期的四組細胞提取細胞總RNA,通過紫外分光光度計對RNA濃度及純度進行測定。每組取5μL總RNA，通過反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，以此為模板進行PCR擴增，之后予2%瓊脂糖凝膠電泳，Band Scan 6.0圖像分析軟件對各電泳條帶灰度值進行分析，目的條帶的灰度值與內參灰度值的比值為miRNA和ZBTB7A mRNA的相對表達量。每個樣品分析3次。

2.3 免疫印跡法在細胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，通過12%SDS變性聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離獲得的蛋白質，轉移至PVDF膜，封閉后將膜加入目標蛋白的抗體ZBTB7A（1：1000，劍橋，英國）或β-actin（1：1000）進行孵育2h，經洗膜封閉再將膜置于含HRP標記的二抗，ECL反應顯色、曝光。進行3次獨立的蛋白免疫印跡分析實驗。

2.4 細胞遷移與體外侵襲實驗使用8μm孔徑（24-well insert、Corning、紐約、美國）的Transwell，對體外細胞遷移和侵襲能力的測定[4]。通過48h的轉染后再對細胞進行消化，在每個8μm孔徑的小室中鋪入80μL的1：8基質膠，在每個小室中接種1×105個轉染后的細胞，添加100μL不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在Transwell的下室中加入含有血清的完全RPMI1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育24h，棉簽拭去上室細胞，用4%多聚甲醛進行15min的固定后用結晶紫常規(guī)染色10min，最后顯微鏡下隨機選取5個視野拍照并計數。在遷移實驗中不需要在小室中鋪基質膠，于培養(yǎng)箱中孵育16h。

2.5 熒光素酶報告基因檢測質粒構建參照文獻[2]。將推定的miR-100的基因啟動子區(qū)域包含的結合位點通過PCR擴增放大并亞克隆到pGL3-Basic載體上游區(qū)（Promega）。從SGC7901細胞和BGC823細胞中提取Total RNA，并擴增出ZBTB基因的3'UTR區(qū)，3'-UTR片段與pmirGLO載體連接。分別將PremiR-100及NC與構建好的熒光載體共轉染至胃癌細胞內，于12孔板中37℃下孵育48h，用細胞裂解液將細胞裂解，取50μL裂解液轉移至96孔板內，每孔加50μL螢火蟲、海腎熒光素酶底物，于高靈敏度化學發(fā)光檢測儀上檢測并讀取平均值。進行3次獨立的熒光素酶報告基因實驗。

2.6 統(tǒng)計學方法應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以均數±標準差（x±s） 表示,并進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，多組均數比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，Spearman相關分析檢測miR-100和ZBTB7A表達水平之間的關系。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 胃癌細胞ZBTB7A是miR-100的直接功能靶基因熒光素酶報告基因檢測顯示在miR-100中過度表達的SGC7901和BGC823細胞中，與熒光素酶活性相關的ZBTB7A pmirglo3′UTR載體顯著減少,與陰性對照組比較，分別下調（46.4±1.9）%和（55.7± 2.3）%（P均＜0.01）。當miR-100被敲除時，ZBTB7A pmirglo-3′UTR載體相關的熒光素酶的活性分別上調（32.7±1.9）%和（25.4±3.3）%（P均＜0.05）。見圖1（封二）。

3.2 miR-100表達水平與胃癌細胞ZBTB7A蛋白表達呈負相關免疫印跡法實驗表明，過表達的miR-100導致SGC7901和BGC823細胞中的ZBTB7A表達的蛋白水平分別降低（81.8±3.8）%（P＜0.01）和（62.9± 1.3）%（P＜0.05）。當miR-100被敲除時，ZBTB7A的蛋白水平出現分別上調（38.1±2.7）%（P＜0.05）和（46.5± 3.4）%（P＜0.05），見圖2（封二）。spearman相關性分析：miR-100表達水平與胃癌中ZBTB7A蛋白表達呈負相關，見圖3（封二）。

3.3 ZBTB7A下調抑制胃癌細胞的遷移和侵襲與空質粒轉染的Si-陰性對照組比較，通過si-ZBTB7A敲除SGC7901和BGC823細胞中的ZBTB7A后，RT-qPCR檢測SGC7901和BGC823細胞中的ZBTB7AmRNA和蛋白表達顯著減少，分別下調（84.6±2.9）%（P＜0.01）和（70.4±1.2）%（P＜0.05），免疫印跡法檢測SGC7901和BGC823細胞中ZBTB7Am-RNA和蛋白表達分別下調（56.9±2.9）%和（73.2± 1.2）%（均P＜0.01），見圖4（封二）。通過Transwells對體外胃癌細胞遷移和侵襲能力的測定，ZBTB7A敲除的胃癌細胞的遷移和侵襲能力被抑制，SGC7901胃癌細胞轉移細胞數下降（59.4±1.3）%（P＜0.01），侵襲細胞數下降（48.4±2.7）%（P＜0.05），BGC823胃癌細胞轉移細胞數下降（36.4±2.4）%（P＜0.05），侵襲細胞數下降（41.9±3.0）%（P＜0.05），見圖5～6（封二）。顯示提示在胃癌的發(fā)病機制中，ZBTB7A可能扮演了重要角色，將有可能作為判斷胃癌患者預后的生物標志物。見表1～2。

表1 SGC7901 transwell遷移、侵襲能力（x±s）

表2 BGC823 transwell遷移、侵襲能力（x±s）

4 討論

目前已知miR-100是兒童腎上腺皮質腫瘤和卵巢透明細胞癌的mTOR基因的靶點[5-6]。在急性髓系白血病，miR-100通過下調RBSP3促進癌細胞增殖[7]。miR-100在胃癌組織和細胞系中也出現顯著下調，miR-100的下調促進了胃癌細胞在體外和體內的侵襲和轉移[8]。

ZBTB7A是POK（POZ/BTB and Kruppel）轉錄因子家族的一個成員，可直接結合到啟動子區(qū)域并對糖酵解關鍵基因的轉錄抑制。以往研究表明，ZBTB7A在多種腫瘤的原癌基因失調中扮演了重要的角色[9]。在一些文獻中ZBTB7A曾被描述為前列腺癌[10]和結腸癌[11]的一個腫瘤抑制基因，在這些腫瘤中，ZBTB7A的缺乏使其表現出更強的侵襲性，但是腫瘤相關基因受到不同的機制調控，因此在不同的人類腫瘤中表現出不一致的功能。Mann等[12]報道ZBTB7A通過抑制ARF促進細胞轉化，ZBTB7A也促進細胞增殖和轉基因小鼠淋巴瘤的形成。Fang等[13]發(fā)現ZBTB7A通過p53、p21和p27的表達來促進細胞增殖。

許多科研工作者通過研究發(fā)現MicroRNAs對胃癌的發(fā)生及轉歸存在重要的作用，陳宗科等[14]發(fā)現miR-24在胃癌細胞株SGC-7901和BGC-803及胃癌組織中的表達呈現上調，可能參與了胃癌發(fā)生；林巧愛等[15]發(fā)現miR-143在胃癌組織較癌旁正常胃黏膜組織中的表達呈現下調，在胃癌分化度的區(qū)分上有更好的敏感性及特異性。然而在人類胃癌中miR-100的功能及其臨床病理意義尚未描述清楚，前面有論述miR-100在胃癌組織和細胞系中也出現顯著下調[9]，然而關于miR-100下調后ZBTB7A表達以及miR-100與ZBTB7A的關系目前尚無相關文獻進行研究以及解釋，因此本研究基于ZBTB7A基因是否是miR-100的靶點，以及對胃癌的轉移和侵襲的聯系仍然未知為出發(fā)點，探究胃癌中miR-100的異常表達對ZBTB7A基因的作用，為臨床治療提供可靠的分子機制。

本研究通過雙熒光素酶報告基因與免疫印跡法發(fā)現miR-100過度表達的SGC7901和BGC823細胞中，與熒光素酶活性相關的ZBTB7A 3′UTR載體顯著減少，ZBTB7A表達的蛋白水平降低。同時觀察到人胃癌中ZBTB7A的表達與miR-100之間呈負相關。這證實ZBTB7A是miR-100在胃癌中的靶基因。發(fā)現通過SiRNA敲除ZBTB7A顯著減少了體外培養(yǎng)的胃癌細胞的遷移和侵襲能力，提示在胃癌的發(fā)病機制中，ZBTB7A可能扮演了重要角色，將有可能作為判斷胃癌患者預后的生物標志物。

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（收稿：2016-04-23修回：2016-07-13）

Expression of m iR-100 and Its Effect on ZBTB7A Gene in Gastric Cancer

Fang Ying,Zhang Xiaoping,Wu Wanxin.Department of Pathology,First Hospital of Jiaxing,Jiaxing(314000)，China

Objective To investigate on the effect of miR-100 expression on ZBTB7A gene in gastric cancer. Methods Gastric cancer cell lines SGC-7901（poorly differentiated and metastasized）and BGC-823（poorly differentiated）were used in this study.They were divided into 8 groups：SGC-7901miR-100 group,SGC-7901miR-100-inhibited group,SGC-7901 Si-negative control group,and SGC-7901 Si-ZBTB7A group,BGC-823miR-100 group, BGC-823miR-100-inhibited group,BGC-823miR-100 negative control group,and BGC-823 Si-ZBTB7A group. Real-time quantitative PCR was used to analyze the mRNA expression of miR-100 and ZBTB7A;Western blot was used to detect the level of ZBTB7A protein;cell migration and invasion assay was used to assess in vitro the migration and invasion ability of cells.The luciferase activity of ZBTB7A 3'UTR vector was measured by plasmid construction and dual-luciferase report assay.Results The relative luciferase activity of the ZBTB7A 3'UTR vector were significantly reduced in miR-100 overpressing SGC7901 and BGC823 cells by（46.4±1.9）%and（55.7±2.3）%, respectively;when miR-100 was knocked down,the upregulated luciferase activity of ZBTB7A 3'UTR vector was observed by（32.7±1.9）%and（25.4±3.3）%,respectively.Western blot results showed that overexpression of miR-100 reduced the protein level of ZBTB7A in SGC7901 and BGC823 cells by（81.8±3.8）%and（62.9±1.3）%,respectively; the protein level of ZBTB7A was upregulated by（38.1±2.7）%and（46.5±3.4）%when miR-100 was knocked down. Conclusion ZBTB7A is a direct target of miR-100 in gastric cancer.The expression of miR-100 can downregulate the expression of ZBTB7A,resulting in inhibiting the metastasis and growth of gastric cancer.

gastric cancer;miR-100;ZBTB7A

浙江省嘉興市第一醫(yī)院病理科（嘉興314000）

方瑩，Tel：13857329715；E-mail：64111309@qq.com