戴飛飛 謝長生

南方紅豆杉水提物通過Ras/MAPK信號通路調控HER2陽性胃癌移植瘤生長實驗研究

戴飛飛1謝長生2

目的探討南方紅豆杉水提物通過抑制Ras/MAPK信號通路相關靶點蛋白表達，調控裸鼠HER2陽性胃癌移植瘤生長及其機制。方法建立荷瘤裸鼠模型，將80只BALB/c裸鼠接種人表皮生長因子-2（HER2）陽性胃癌NCI-N87細胞株，并隨機分組給藥及取瘤，采用Western Blot檢測HER2、KRAS蛋白表達，RT-PCR定量檢測HER2、KRAS mRNA表達水平。結果①Western blot檢測HER2、KRAS蛋白：與空白組比較，各給藥組HER2、KRAS蛋白表達不同程度下調[HER2：（1.238±0.123、1.180±0.152、1.159±0.087、0.876±0.098、0.651±0.108、0.554±0.110）比（1.482±0.101），P＜0.05或P＜0.01；KRAS：（0.768±0.040、0.680±0.019、0.821±0.170、0.716±0.023、0.630±0.049、0.739± 0.044）比（1.015±0.033），P均＜0.05]；與赫賽汀組比較，中劑量聯(lián)合組KRAS蛋白表達顯著下調（0.630±0.049比0.759±0.029，P＜0.05）；②RT-PCR檢測HER2、KRAS mRNA表達：與空白組比較，各給藥組HER2、KRAS mRNA表達不同程度下調[HER2 mRNA：（0.916±0.026、0.783±0.061、0.846± 0.021、0.741±0.079、0.660±0.079、0.673±0.045）比（1.000±0.193），P均＜0.05；KRAS mRNA：（0.643± 0.065、0.551±0.173、0.572±0.267、0.329±0.250、0.036±0.007、0.351±0.257）比（1.001±0.132），P＜0.05或P＜0.01]；與赫賽汀組比較，中劑量聯(lián)合組KRAS mRNA表達顯著下調（0.036±0.007比0.362± 0.162，P＜0.01）。結論南方紅豆杉水提物可通過Ras/MAPK信號通路部分下調HER2、KRAS蛋白及其mRNA表達水平，聯(lián)合赫賽汀可增強其抑制作用。

裸鼠；胃癌；Ras/MAPK；南方紅豆杉；曲妥珠單抗；表皮生長因子受體

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多靶點、多環(huán)節(jié)的信號傳導通路錯綜復雜的過程。實驗研究發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗（trastuzumab，herceptin，TM）主要通過拮抗人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）信號傳達通路而發(fā)揮抑制腫瘤細胞的生長，且激活腫瘤細胞凋亡信號或通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒活性導致腫瘤細胞的凋亡[1-3]。Ras/MAPK信號通路是HER2下游重要信號通路之一，其通過影響細胞內基因的表達、轉錄及調控繼而影響細胞生長、代謝等生物學行為，引起腫瘤的產(chǎn)生及惡變[4]。藥理研究顯示，紅豆杉中的40多種有效成分具有抑制腫瘤細胞增殖及血管增生、抗腫瘤浸潤及轉移的作用[5]。本實驗通過建立荷瘤裸鼠模型，觀察不同劑量南方紅豆杉及曲妥珠單抗單藥或聯(lián)合給藥對Ras/MAPK信號通路相關靶點的作用，并從蛋白及mRNA表達水平探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物BALB/c裸鼠80只，4～6周齡，體質量18～20g。上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，實驗生物合格證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 試劑及儀器Hylcone胎牛血清（美國Thermo公司），RPMI-1640培養(yǎng)液（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司），HER2抗體、KRAS抗體（美國Cell Signaling公司），辣根過氧化物酶標記的抗鼠、抗兔二抗（美國Santa Cruz公司），Marker（加拿大Fermentes公司）。蛋白印跡檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），定量PCR儀器（美國ABI公司），Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）。

1.3 藥物及其制備南方紅豆杉（規(guī)格8g/包，由寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號100513）。南方紅豆杉水提物的制備[6]：8g南方紅豆杉浸泡過夜，加7倍水煮沸20min后倒出藥液，再加5倍水煮20min，再將兩次藥液混勻經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀，蒸發(fā)濃縮至208mg/mL，靜置過夜后用過濾網(wǎng)清除藥渣，將剩余藥液作為高劑量母液，再按1：2和1：4體積純水稀釋出中劑量提取液104mg（生藥量）/mL，低劑量提取液52mg（生藥量）/mL，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ字閱慰梗ㄉ唐访汉召愅?，Herceptin，規(guī)格440mg/瓶，上海羅氏制藥有限公司，批號N3586），赫賽汀溶液配制：用20mL滅菌注射用水配制成無色至淡黃色透明液體作為母液，濃度21mg/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞培養(yǎng)人胃癌細胞株NCI-N87，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。用10%胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)液，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，細胞貼壁生長后取對數(shù)生長期細胞。

2 實驗方法

2.1 動物模型建立及分組給藥第1天取對數(shù)生長期的人胃癌NCI-N87細胞株接種于每只裸鼠右側腋窩下，待第7天觀察瘤體情況并將80只BALB/c裸鼠隨機分為空白組、紅豆杉高劑量組、紅豆杉中劑量組、紅豆杉低劑量組、Herceptin聯(lián)合紅豆杉（高、中、低）劑量組，赫賽?。℉erceptin）單藥組，共8組，每組10只。同時開始給藥灌胃，每次3mL中藥濃縮液，空白組給予與南方紅豆杉同等體積的生理鹽水灌胃，共給藥3周。接種后第28天取瘤用于瘤組織蛋白提取檢測蛋白表達及免疫組化檢測。

2.2 Western Blot檢測蛋白表達取適量瘤組織加入RIPA裂解液（含PMSF），進行勻漿再置于冰上，并重復3次。裂解30min后進行4℃下12 000r/min離心5min。取上清液放入-20℃水箱保存；用BCA法進行蛋白濃度測定，計算待測蛋白樣品濃度；然后進行SDS-PAGE電泳；最后用quantity one軟件測定各條帶的灰度值（A），各組的A值與相應的β-actin的A值的比值代表蛋白的相對表達量。

2.3 實時定量PCR檢測基因表達取出適量保存在液氮中的移植瘤組織約50mg放入2mLEP管中進行組織總RNA提取和純化（RNeasy Mini Kit），再吸取1μL抽提的RNA在Nan odropl000上進行RNA濃度測定，若OD260/ OD280為1.8～2.0，表明RNA樣品可以使用。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外光觀察28s、18s、5s三條條帶，以確定RNA的完整性。然后RNA逆轉錄成cDNA，最后進行PCR擴增（引物合成主要由上海生工設計）。見表1。

表1 RT-PCR各對應引物序列

按照Power SYBR Green PCR試劑盒說明進行操作，以cDNA為模板，GAPDH為內參來檢測標本中各基因的表達水平。反應體系：10μmol/ L primer（上下游）0.5μL，SYBR 2.5μL，滅菌雙蒸水1μL，cDNA 1μL；擴增條件為：預變性95℃、5min預變性，94℃、1min，退火1min，72℃、1min延伸，進行32個循環(huán)后，72℃8min終末延伸。用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值分析目的基因的相對表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS22.0統(tǒng)計進行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s） 表示，計量資料的多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 Western Blot檢測各組瘤組織HER2、KRAS蛋白表達用quantity one軟件分析并與βactin灰度值比值顯示結果，與空白組比較，各給藥組HER2、KRAS蛋白表達均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）；與赫賽汀組比較，各給藥組的HER2蛋白表達不同程度上調（P＜0.05或P＜0.01）；中劑量紅豆杉組及聯(lián)合組KRAS蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 各組小鼠瘤組織HER2、KRAS蛋白表達量比較（x±s）

圖1 各組小鼠瘤組織HER 2、KRAS蛋白表達

3.2 RT-PCR檢測各組瘤組織HER2、KRAS mRNA表達與空白對照組比較，各給藥組HER2、KRAS mRNA表達均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）；與赫賽汀組比，各給藥組可不同程度上調HER2 mRNA表達（P＜0.05或P＜0.01），中劑量聯(lián)合組顯著下調KRAS mRNA表達（P＜0.01）。見表3，圖2～3。

4 討論

南方紅豆杉Taxus chinensis var.Mairei為紅豆杉屬的常綠針葉植物，其又被稱作“紫杉”。藥理研究[7]顯示，紅豆杉提取物可促進白介素1、2，腫瘤壞死因子，干擾素等細胞因子的合成；激活巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞，調節(jié)抗體和補體而明顯提高免疫功能。

實驗研究[8]發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗對HER2高表達的NCI-N87胃癌細胞具有抗體依賴的細胞介導的毒性作用并且可顯著增強抗腫瘤活性。HER2是具有受體酪氨酸激酶（RTK）活性的原癌基因，是細胞增殖、胚胎發(fā)育、組織分化的重要介質[9]。膜受體酪氨酸蛋白激酶信號傳導（Ras/ MAPK）途徑是廣泛存在于細胞中的一條關鍵性調控細胞生存與凋亡的傳導通路。其主要作用機制：在細胞外信號誘導下，HER2/neu與其他EGF受體形成二聚體，激活細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），使其由胞質轉位到核內，最終影響核內轉錄因子，調節(jié)基因轉錄及表達[10]。KRAS是Ras家族成員之一，研究表明，胃癌組織KRAS蛋白表達率高于癌旁組織，且與腫瘤組織的浸潤、腫瘤分期及淋巴結轉移相關，提示KRAS蛋白過表達在胃癌轉移進展中發(fā)揮重要作用[11-12]。

本實驗研究顯示，與空白對照組比較，各用藥組HER2蛋白表達下調，提示紅豆杉水提物及赫賽汀通過降低HER2蛋白在胃癌細胞表面的表達，繼而抑制HER2蛋白與其他受體酪氨酸激酶形成異源二聚體，干擾自身磷酸化從而阻斷下游信號傳導通路的持續(xù)激活。另外，實驗結果還顯示，與空白組比較，各給藥組KRAS表達可不同程度下調，顯示南方紅豆杉水提物及曲妥珠單抗通過使Sos無法激活Ras功能性活化蛋白表皮生長因子受體HER2的活性，從而抑制KRAS活化，繼而無法激活其下游相關效應因子來阻斷下游信號傳導通路最終抑制細胞生長，誘導凋亡。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉水提物作用于人HER2陽性人NCI-N87胃癌細胞荷瘤裸鼠移植瘤后，總體上HER2、KRAS蛋白表達較空白組可有不同程度下調。表明經(jīng)南方紅豆杉水提物干預，可下調HER2、KRAS蛋白（EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK）傳導通路上的表達，使信號通路受阻而抑制HER2陽性人NCI-N87胃癌細胞增殖。本實驗中Western blot與RT-PCR檢測結果基本一致，但兩種檢測方法顯示南方紅豆杉水提物作用于HER2、KRAS蛋白的最有效濃度存在一定的差異性，這可能與不同劑量藥物對Ras/MAPK信號通路上不同位點調控的程度不同相關。

綜上所述，本實驗結果表明，南方紅豆杉水提物可部分下調HER2、KRAS蛋白及其mRNA及表達水平，聯(lián)合赫賽汀可增強其抑制作用。

表3 各組小鼠瘤組織HER2、KRAS蛋白表達量比較（x±s）

圖2 HER 2范圍擴增溶解曲線

圖3 HRAS范圍擴增溶解曲線

［1］Cuello M，Ettenberg SA，Clark AS，et al.Down-regulation of the erbB-2 receptor by trastuzumab（herceptin）enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligandmediated apoptosis in breast and ovarian cancer cell lines that overex-presserbB-2［J］.CancerRes，2001，61（12）：4892-4900.

［2］張擇偉，寧守斌，進展期胃癌分子病治療的新進展［J］.胃腸病學，2012,17（4）：251-254.

［3］Hung MC，Lau YK.Basic science of HER2/neu：A review［J］.Semin Oncol，1999，26（4 Suppl 12）：51-59.

［4］邱建武，郭薇，申麗娟.p38MAPK在肝細胞癌中的研究進展［J］.世界華人消化雜志，2009，16（5）：503-509.

［5］Ozols RF.USA update on pacilitaxl in ovarian cancer［J］.Ann Med，1995，27：127-128.

［6］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.人民衛(wèi)生出版社，2006.

［7］Kim ES，Salgia R.MET pathway as a therapeutic target［J］.J Thorac Oncol，2009，4（4）：444-447.

［8］Wainberg，ZA，Anghel，A，Desai，AJ，et al.Lapatinib，a dual EGFR and HER2 kinase inhibitor，selectively inhibits HER2-amplified human gastric cancer cells and is synergisticwith trastuzumab in vitroand in vivo［J］.Clin Cancer Res，2010，16（5）：1509-1519.

［10］Friday BB，Adjei AA.Advances in targeting the Ras/Raf/ MEK/Erk mitogen-activated protein kinase cascade with MEK inhibitors for cancer therapy［J］.Clin Cancer Res，2008，14（2）：342-346.

［11］Motojima K，F(xiàn)urui J，Kohara N，et al.Expression of Kirstenras p21 in gastric cancer correlates with tumor progression and is prognostic［J］.Diagn Mol Pathol，1994，3（3）：184-191.

［12］劉志敏，呂申.胃癌中hMSH2表達缺失對EGFR及KRAS基因突變影響的研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2014，22（12）：2908-2911.

（收稿：2016-07-13修回：2016-08-05）

Taxus Chinensis Water Extract Inhibited the Growth of HER2-positive Gastric Cancer through Regulating Ras/MAPK Signaling Pathway

DAI Feifei1,XIE Changsheng2.1 ICU,Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of taxus chinensis water extract on human epidermal growth receptor 2（HER2）-positive gastric cancer via regulating Ras/MAPK pathway related proteins.M ethods Nude mouse model bearing HER2-positive gastric cancer was established by inoculating NCI-N87 tumor strain.Eighty BALB/c mice were randomized into high-,middle-,low-dose taxus chinensis groups,high-,middle-,low-dose taxus chinensis+herceptin groups,and herceptin group and given the corresponding drugs.Mice were killed by cervical dislocation to obtain tumor tissue for inspection.The protein expression of HER2 and KRAS were detected with Western Blot and mRNA contents of the genes were determined by RT-PCR assay.Results Compared with blank group,the expression of HER2 and KRAS proteins were decreased in all drug groups（HER2：1.238±0.123,1.180± 0.152,1.159±0.087,0.876±0.098,0.651±0.108,0.554±0.110 vs 1.482±0.101,P＜0.05 or P＜0.01;KRAS：0.768± 0.040,0.680±0.019,0.821±0.170,0.716±0.023,0.630±0.049,0.739±0.044 vs 1.015±0.033,all P＜0.05）.Compared with that in herceptin group,KRAS protein in middle-dose taxus chinensis+herceptin group was significantly decreased（0.630±0.049 vs 0.759±0.029,P＜0.05）.Compared with blank group,the expression of HER2 and KRASmRNA were decreased in all drug groups（HER2 mRNA：0.916±0.026,0.783±0.061,0.846±0.021,0.741±0.079, 0.660±0.079,0.673±0.045 vs 1.000±0.193,all P＜0.05；KRAS mRNA：0.643±0.065,0.551±0.173,0.572±0.267, 0.329±0.250,0.036±0.007,0.351±0.257 vs 1.001±0.132,P＜0.05or P＜0.01）.Compared with that in herceptin group, KRAS mRNA in middle-dose taxus chinensis+herceptin group was significantly decreased（0.036±0.007 vs 0.362± 0.162,P＜0.01）.Conclusion Taxus chinensis water extract can down regulate the expression of HER2,KRAS protein and mRNA via Ras/MAPK pathway in mice with gastric cancer.When it is combined with herceptin,its anti-tumor effect is enhanced.

nude mice;gastric cancer;Ras/MAPK;Taxus chinensis water extract;trastuzumab;epidermal growth receptor

浙江省自然科學基金（No.LY13H290013）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2013ZA043）

1浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院ICU（杭州310005）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科（杭州310006）

謝長生，Tel：0571-87071083