沈　霖　　馬　陳　　帥　波　　楊艷萍　　徐曉娟　　夏　雪　　呂　林

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢　430022

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·臨床研究·

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者ADAM17介導(dǎo)的凝血酶受體水解活性研究及加味青娥丸對其的干預(yù)效應(yīng)*

沈霖馬陳帥波△楊艷萍徐曉娟夏雪呂林

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢430022

摘要目的觀察加味青娥丸對非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(ONFH)患者解離素金屬酶17(ADAM17)介導(dǎo)的凝血酶受體水解活性的影響，探討加味青娥丸治療缺血性O(shè)NFH的機制。方法招募臨床診斷為非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者60例，隨機分為治療組及對照組，治療組給予加味青娥丸及補鈣治療，對照組給予模擬劑及補鈣治療，2組療程均為6個月，2組患者適當(dāng)限制運動及負重，另招募60例健康體檢者作為健康組。抽取2組患者治療前后及健康組靜脈血，采用ELISA法檢測受試者血漿中ADAM17表達水平；流式細胞儀檢測受試者凝血酶受體GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅠbα的表達，同步觀察患者治療前后髖關(guān)節(jié)功能評分(Harris評分)及髖部X攝片影像學(xué)變化，比較3組上述指標(biāo)的差異。結(jié)果非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者ADAM17表達水平明顯低于健康組；GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅠbα高于健康組。治療6月后，治療組ADAM17顯著高于對照組，GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅠbα表達水平顯著低于對照組；治療組髖關(guān)節(jié)Harris評分優(yōu)于對照組；2組髖部X攝片影像學(xué)無明顯差異。結(jié)論中藥加味青娥丸方提高非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者低于正常的ADAM17含量，調(diào)節(jié)其介導(dǎo)的凝血酶受體水解活性，可能是本方治療非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者的療效機制之一。

關(guān)鍵詞股骨頭壞死；青娥丸；解離素金屬酶；凝血酶受體

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head，ONFH)的發(fā)病機制復(fù)雜，多由于應(yīng)用激素及過度飲酒等導(dǎo)致機體脂肪代謝紊亂及血管內(nèi)凝血，形成血栓或脂肪栓子，堵塞股骨頭滋養(yǎng)血管，使骨質(zhì)缺血、變性、壞死[1-3]。前期的研究[4-6]已經(jīng)證實，股骨頭缺血性壞死患者血小板高聚集，血液呈高凝低纖溶狀態(tài)，循環(huán)血中可溶性GPⅠbα糖盞蛋白(glycocalicin，GC)的含量明顯低于正常。近年來研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，GC是血小板膜上一種解離素金屬酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)17水解凝血酶受體(glycoprateins，GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物的關(guān)鍵組分GPⅠbα，釋放出的胞外段功能區(qū)形成可溶性分子。長期的臨床實踐[9-10]表明，運用古方青娥丸加丹參治療ONFH，具有補腎活血之功。為此，本文觀察了非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者ADAM17介導(dǎo)的凝血酶受體水解活性的變化及加味青娥丸對其的干預(yù)效應(yīng)，旨在探討中醫(yī)補腎活血法治療非創(chuàng)傷性O(shè)NFH的療效機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

搜集2013年10月—2015年6月在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合骨傷科門診就診的ONFH患者60例，其中男26例，女34例，平均年齡(38.12±3.90)歲。其中12例有長期飲酒史，35例有激素使用史，另外13例原因不明。根據(jù)國際骨循環(huán)研究會(Association Research Circulation Osseous，ARCO)診斷分型，其中Ⅱ型35例，Ⅲ型43例；單側(cè)ONFH 36例，雙側(cè)ONFH 24例。經(jīng)中醫(yī)辨證屬于血瘀腎虛型。

60例患者隨機分為加味青娥丸治療組(治療組)及青娥丸模擬劑治療組(對照組)，每組各30例。治療組，其中男12例，女18例；平均年齡(37.24±3.63)歲；平均體重指數(shù)(23.38±3.14) kg/m2；髖關(guān)節(jié)的ARCO分期：Ⅱ期17髖，Ⅲ期22髖。對照組，其中男14例，女16例；平均年齡(39.32±2.94)歲；平均體重指數(shù)(23.69±4.12) kg/m2；髖關(guān)節(jié)的ARCO分期：Ⅱ期18髖，Ⅲ期21髖。2組患者在性別、年齡、體重指數(shù)及髖關(guān)節(jié)ARCO分期等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。另選60例門診體檢中心健康體檢者為健康組，其中男26例，女34例；平均年齡(37.28±4.10)歲，體檢正常，均無長期飲酒及激素使用史，既往無心腦血管、高血壓、糖尿病病史。本研究已得到武漢協(xié)和醫(yī)院研究中心倫理委員會批準(zhǔn)，所有參加本研究的受試者均表示同意并簽署知情同意書。

1.2排除標(biāo)準(zhǔn)

所有入選患者均排除：①具有明確的髖關(guān)節(jié)外傷史；②合并有嚴(yán)重的心、肝、肺、腎疾病、脂質(zhì)代謝紊亂及血液系統(tǒng)疾?。虎廴焉锘驕?zhǔn)備妊娠或哺乳期婦女；④在本檢查前2周內(nèi)，服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀類中藥等影響血小板功能的藥物；⑤研究者認為不宜入選本試驗者。

1.3方法

1.3.1試驗用藥加味青娥丸由補骨脂160 g(酒浸，炒)，杜仲80 g(去皮，姜汁浸，炒)，胡桃(去皮、膜)60個，丹參160 g組成，中藥飲片均購自湖北省中藥材公司，上藥為細末，蒜(熬膏)60 g，蒜膏為丸。對照藥除輔料外不含任何藥物成分，劑型、規(guī)格與加味青娥丸相似。2種藥物均由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中藥房制作。鈣爾奇D(國藥準(zhǔn)字H10950029)為惠氏制藥有限公司產(chǎn)品。

1.3.2治療方法治療組口服加味青蛾丸，每次15 g，每日3次；對照組服用加味青娥丸模擬劑，每次15 g，每日3次。2組均同時服用鈣爾奇D，每次600 mg/片，每日1次。治療期間禁止使用其他影響骨代謝及降脂作用的中西藥物。2組用藥同時均采用患髖皮牽引輔助治療，每日2次，每次1 h，同時患髖避免負重活動，必要時配合扶拐行走。2組療程均為6個月。

1.4臨床評價與觀察指標(biāo)

1.4.1臨床評價記錄所有受試者的年齡、性別、身高、體重。在入組時及每次隨訪行髖關(guān)節(jié)功能評分(Harris評分)，在治療前及治療6個月后均行雙髖關(guān)節(jié)正側(cè)位X攝片。1.4.2ADAM17檢測人ADAM17(TACE)ELISA試劑盒由西塘公司提供，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法進行檢測。經(jīng)肘正中靜脈采集所有受試者治療前后及健康體檢者清晨空腹靜脈血，分離血漿。標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1 ml蒸餾水混勻，配成20 ng/ml的溶液，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第1管加標(biāo)本稀釋液900 μl，第2～8管加入標(biāo)本稀釋液500 μl。在第1管中加入20 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μl混勻后，用加樣器吸出500 μl，移至第2管，如此反復(fù)作對倍稀釋，從第7管中吸出500 μl棄去，第8管為空白對照。10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1：10倍稀釋(示例：1 ml濃稀釋液加入9 ml蒸餾水)。洗滌液：用重蒸水1：20稀釋(示例：1 ml濃縮洗滌液加入19 ml的重蒸水)。加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃、120 min。洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干，每孔中加入第一抗體工作液100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃、60 min；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μl，將反應(yīng)板置37 ℃ 30 min；每孔加入底物工作液100 μl，置37 ℃暗處，反應(yīng)15 min；每孔加入100 μl終止液混勻，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值。

1.4.3GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ與GPⅠbα檢測藻紅素(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的GPⅠbα單克隆抗體CD42b為美國BioLegend公司產(chǎn)品，GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物單克隆抗體CD42a-b-c-d為美國ALEXIS公司產(chǎn)品，異硫氰酸熒光(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記二抗為美國KPL公司產(chǎn)品。采用真空采血管(美國BD公司)，清晨空腹靜脈血3 ml，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑的比例為9：1。將抗凝后全血，以1%多聚甲醛固定45 min，取50 μl加至流式檢測管，后分別在不同管中加入20 μl GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物單克隆抗體CD42a-b-c-d和PE標(biāo)記的GPⅠbα單克隆抗體CD42b，混勻，室溫避光孵育30 min，然后在CD42a-b-c-d標(biāo)記的樣本中加入20 μl FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，混勻，室溫避光孵育30 min。用0.2 M PBS定容至500 μl，于FACS420型流式細胞儀上檢測，每個樣本分析104個/血小板，結(jié)果以平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)表示。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1治療前后Harris評分與髖關(guān)節(jié)X攝片

治療組30例中，有28例(35髖)患者完成了本試驗，2例患者脫落，其中1例因治療4周后，癥狀無改善要求退出，1例因治療過程中，到國外探親，未按期用藥。對照組30例中，有27例(34髖)患者完成了本試驗，2例因療效不佳要求退出，1例失訪。治療前2組患者的髖關(guān)節(jié)Harris評分無明顯差異(t=0.275，P=0.784)。治療6個月后，治療組Harris評分顯著高于治療前(t=5.490，P<0.001)；對照組治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.622，P=0.111)，且治療后治療組患者Harris評分明顯高于對照組(t=2.954，P=0.005)。2組治療前后X攝片影像學(xué)無變化。見圖1。

與治療前比較*P<0.05；與對照組比較▲P<0.05圖1　治療組與對照組Harris評分圖

2.23組ADAM17、GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα檢測

治療前，治療組與對照組ADAM17水平比較無明顯差異(t=0.372，P=0.711)，但均明顯低于健康對照組(t=2.934，P=0.004；t=2.333，P=0.022)。治療6個月后，治療組ADAM17水平明顯高于治療前與對照組(t=3.786，P<0.001；t=2.736，P=0.008)；對照組與治療前比較無明顯差異(t=0.126，P=0.901)。見圖2。

與健康組比較△P<0.05；與治療前比較*P<0.05；與對照組比較▲P<0.05圖2　3組ADAM17表達水平的圖

治療前，治療組與對照組GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ水平比較無明顯差異(t=0.023，P=0.982)，但均明顯高于健康對照組(t=3.344，P=0.001；t=3.122，P=0.002)。治療6個月后，治療組GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ水平明顯低于治療前與對照組(t=2.556，P=0.013；t=2.698，P=0.009)；對照組與治療前比較無明顯差異(t=0.185，P=0.854)。見圖3。

與健康組比較△P<0.05；與治療前比較*P<0.05；與對照組比較▲P<0.05圖3　3組GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ表達水平圖

治療前，治療組與對照組GPⅠbα水平無明顯差異(t=0.169，P=0.866)，但均明顯高于健康對照組(t=2.725，P=0.008；t=2.813，P=0.006)。治療6個月后，治療組GPⅠbα水平明顯低于治療前與對照組(t=2.268，P=0.027；t=2.471，P=0.017)；對照組與治療前比較無明顯差異(t=0.092，P=0.927)。見圖4。

與健康組比較△P<0.05；與治療前比較*P<0.05；與對照組比較▲P<0.05圖4　3組GPⅠbα表達水平圖

3討論

既往研究已經(jīng)證實[4-5]，非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者血小板聚集功能增加，血流動力學(xué)呈高黏血癥狀態(tài)，血小板GPⅡb/Ⅲa、P-選擇素、血小板微顆粒等血小板活化指標(biāo)的表達明顯高于健康人，提示這可能是導(dǎo)致本病患者血液處于高凝易栓塞狀態(tài)的重要原因之一。

近年來發(fā)現(xiàn)，非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者循環(huán)血中GC含量低于正常[6]。有文獻[7-8]表明，血小板膜表面蛋白水解在調(diào)節(jié)血小板功能方面起重要作用。血小板表面的凝血酶受體GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物亞基GPⅠbα，可被血小板膜上的ADAM17水解，釋放出胞外段功能區(qū)形成可溶性分子GC。病理情況下，一旦ADAM17的調(diào)節(jié)發(fā)生障礙，血小板上GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物亞基酶解減少，該復(fù)合物作為凝血酶受體，將過度與凝血酶和vWF結(jié)合，使血小板活化增加，這些改變將引起血管內(nèi)凝血。

本研究發(fā)現(xiàn)，非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者血漿ADAM17含量降低，血小板表面凝血酶受體GP Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物及其關(guān)鍵活性亞基GPⅠbα均高于正常，表明非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者確實存在ADAM17介導(dǎo)的GPⅠbα水解功能障礙。由此分析，ONFH患者各種始發(fā)、觸發(fā)因素，如大量飲酒、激素藥物的使用、骨髓壓力升高及細胞的毒性作用等使血管內(nèi)皮細胞受損，其下膠原暴露，體內(nèi)產(chǎn)生一系列的生物活性因子及相關(guān)反饋等共同作用使得ADAM17不能有效水解凝血酶受體，故出現(xiàn)循環(huán)血中GC減少。凝血酶受體與凝血酶和vWF結(jié)合增加，從而激活血小板，使血細胞聚集，活化的血小板產(chǎn)生大量的GPⅡb/Ⅲa、P-選擇素及血小板微顆粒，使血液處于高凝狀態(tài)，易形成微循環(huán)血栓、栓塞，再加上股骨頭本身的血供特點，易阻斷股骨頭血供從而導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死。

非創(chuàng)傷性O(shè)NFH屬于中醫(yī)“骨蝕”、“骨痹”范疇，病理機制主要為腎虛血瘀。長期服用激素可損傷腎氣，氣虛血運無力成瘀；過度飲酒之熱及腎，腎因火而精少；血受熱而成痰瘀，痰瘀互結(jié)，血脈痹阻不通，骨失所養(yǎng)，而成骨痹、骨蝕。治宜補腎活血，結(jié)合我們前期研究[4-6]，采用古方青娥丸加丹參治療本病。方中杜仲性味甘溫，入肝腎經(jīng)，能補腎、強壯筋骨，故有“凡下焦之虛非杜仲不補，足脛之酸非杜仲不去，腰膝之病非杜仲不除”之說(《本草幾言》)；補骨脂性溫能“暖水臟，陰中生陽壯火益土，對“腎氣虛弱，……起坐艱難者，悉能治之”(《本草經(jīng)疏》)；胡桃肉入腎，補腎固精、通潤血脈；大蒜辛溫走竄，行滯通絡(luò)。四藥合為青娥丸，“治腎氣虛弱，……坐起艱難，俯仰不利，轉(zhuǎn)側(cè)不能，……常服之，壯筋骨，活血脈，烏鬢發(fā)，益顏色”(《局方·青娥丸》)，再加用丹參活血化瘀，諸藥相得益彰，共奏內(nèi)充腎氣、調(diào)達氣血之功。經(jīng)臨床驗證，本方在緩解患髖疼痛，促進患髖關(guān)節(jié)功能改善方面療效明顯[7]。本研究結(jié)果顯示，用本方治療6個月，能有效的干預(yù)患者低于正常的ADAM17含量，使其對GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物及GPⅠbα水解活性恢復(fù)正常，從而改善血小板活化狀態(tài)，以達到控制血管內(nèi)凝血，恢復(fù)血小板聚集功能之功，提示加味青娥丸治療非創(chuàng)傷性O(shè)NFH的療效機制之一，是能夠在受體蛋白水平上調(diào)節(jié)ADAM17介導(dǎo)的凝血酶受體水解活性。有關(guān)本方調(diào)節(jié)血小板凝血酶受體作用的詳細機制有待進一步研究。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4616.2016.03.001

(收稿日期：2016-04-07)

Study on Hydrolysis Activity of Thrombin Receptor Mediated by ADAM17 in Patients with Nontraumatic Osteonecrosis of the Femoral Head and Intervention Effect of Modified Qing’e Pills

SHEN Lin，MA Chen，SHUAI Bo△，et al

DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo observe the intervention effect of modified Qing’e pills on the hydrolysis activity of thrombin receptor mediated by ADAM17 in patients with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head(ONFH)，and to explore its possible mechanism.Methods60 patients with nontraumatic ONFH were randomly divided into a treatment group and a control group.The treatment group was treated with modified Qing’e pills while the control group was treated with simulated pills.Both groups were given Caltrate D.All patients in the two groups received treatment for six months.Another 60 cases of healthy people accepted heath examination were as a healthy group.Plasma levels of ADAM17 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，and platelet membrane glycoproteins(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ complex and its component GPⅠbα were analyzed by flowcytometry in the healthy group and the two intervention groups before and after treatment.While X-ray examination of the hip and Harris hip score were measured in patients with ONFH before and after treatment.ResultsThe level of ADAM17 in patients with ONFH were significantly lower than that in the healthy group(P<0.05).The expression of GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ and GPⅠbα in patients with ONFH were significantly lower than that in the healthy group(P<0.05).After six months treatment，the level of ADAM17 in the treatment group were significantly higher than that in the control group(P<0.05)，and expression of GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ and GPⅠbα in patients with ONFH were significantly lower than that in the control group(P<0.05).Harris hip score in the treatment group was significantly higher than that in the control group.Difference of X-ray examination of the hip was not significant between the treatment group and the control group after treatment(P>0.05).ConclusionModified Qing’e pills may play a protective role against nontraumatic ONFH by regulating the expression adiponectin signaling pathway and ghrelin.The partial mechanism of treating ONFH of modified Qing’e pills is suggested that ADAM17 content is increased in the plasma and hydrolysis activity with thrombin receptor is regulated by ADAM17.

Key wordsosteonecrosis of the femoral head；modified Qing’e pills；ADAM17；thrombin receptor；GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ；GPⅠbα

*國家自然科學(xué)基金項目(No.81273907,81403257)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：bobo3137@126.com