傅明駿，吳 松，唐 蕾，周發(fā)林，邱麗華，江世貴

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，海南 三亞 572028；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

斑節(jié)對(duì)蝦泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表達(dá)分析

傅明駿1，2，吳 松1，3，唐 蕾1，4，周發(fā)林1，邱麗華1，江世貴1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，海南 三亞 572028；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

傅明駿，吳松，唐蕾，等.斑節(jié)對(duì)蝦泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表達(dá)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（4）：144-150.

從斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）肝胰腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得泛素融合蛋白UbL40基因（ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein，PmUbL40）的部分序列，利用RACE技術(shù)克隆其cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析；利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在斑節(jié)對(duì)蝦不同組織及卵巢不同發(fā)育期的表達(dá)情況。結(jié)果表明，PmUbL40基因cDNA全長(zhǎng)571 bp，開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）長(zhǎng)390 bp，編碼129個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約14.7 ku，理論等電點(diǎn)為9.76。預(yù)測(cè)氨基酸序列的N-末端（1～76aa）為高度保守的泛素結(jié)構(gòu)域，C-末端（77～129aa）為典型的核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域。多重序列比對(duì)表明不同物種的UbL40在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示PmUbL40基因在肝胰腺的表達(dá)量最高，肌肉、卵巢次之，其他組織的表達(dá)較低；在卵巢發(fā)育過(guò)程中PmUbL40基因在II期表達(dá)最高，其次是V期，顯著高于I、III、IV期。研究結(jié)果表明PmUbL40基因在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中可能具有重要作用。

斑節(jié)對(duì)蝦；泛素融合蛋白L40；卵巢發(fā)育；基因克隆

泛素-蛋白酶體途徑（UPP）是生物體內(nèi)一種ATP依賴性的蛋白降解途徑，由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2s）、泛素-蛋白連接酶（ubiquitin-protein ligases，E3s）、26 S蛋白酶體等組成，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)降解蛋白，是一種重要的蛋白降解方式。UPP途徑在機(jī)體的許多生理功能中起重要作用，如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 損傷和修復(fù)和免疫應(yīng)答等［1-4］。研究表明，UPP 途徑參與雄性生殖系統(tǒng)的精子發(fā)生、精子成熟和受精等生理活動(dòng)，同時(shí)在雌性的妊娠早期和正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的組織重建、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟和早期胚胎發(fā)育、甾體激素受體的代謝等生理活動(dòng)中均具有重要作用［5-6］。在配子發(fā)生這個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程中，尤其是減數(shù)分裂和配子成熟，UPP途徑參與了蛋白的降解來(lái)確保整個(gè)生理過(guò)程有序進(jìn)行。泛素Ub在卵母細(xì)胞第一次減數(shù)次分裂和第二次減數(shù)分裂過(guò)程中，參與細(xì)胞周期蛋白及其他細(xì)胞蛋白的降解［6-7］；在性腺發(fā)育及配子的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。Ub是真核生物廣泛存的一種球狀蛋白，僅由76個(gè)氨基酸組成，通過(guò)標(biāo)記目標(biāo)蛋白進(jìn)入蛋白酶體后被特異性降解。泛素基因可分為兩類，一種是以重復(fù)基因首尾相連方式形成的聚泛素基因，編碼多聚泛素后被特異的水解酶水解成單個(gè)泛素蛋白；另一種是泛素單體和核糖體形成的融合蛋白，在泛素C末端連接52個(gè)或76～81個(gè)氨基酸延伸部分，52個(gè)氨基酸是核糖體60S亞基組分，與核糖體L40有很高的同源性；76～81個(gè)氨基酸是核糖體40S亞基的組分，與核糖體S27具有很高的同源性。這兩種蛋白被稱為泛素融合蛋白L40 （UbL40）或泛素融合蛋白S27（UbS27）［8］。

斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）作為世界上最主要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一，因其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值備受人們關(guān)注。斑節(jié)對(duì)蝦在卵巢組織學(xué)、性成熟指數(shù)（GSI）、卵細(xì)胞直徑、卵核的大小和形狀、核仁的形態(tài)和分布、不同發(fā)育階段卵細(xì)胞數(shù)量比例等方面將其卵巢周期劃分為6個(gè)時(shí)期，即卵原細(xì)胞期（Ⅰ）、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂前期的前卵黃生成期（Ⅱ）、初級(jí)卵黃生成期（Ⅲ）、次級(jí)卵黃生成期（Ⅳ）、成熟期（Ⅴ）和產(chǎn)后期（Ⅵ）［9-10］。目前，在人工調(diào)控斑節(jié)對(duì)蝦性腺發(fā)育方面主要依賴于切除眼柄來(lái)誘導(dǎo)卵巢發(fā)育。但是切除眼柄技術(shù)仍然存在許多問(wèn)題，親蝦對(duì)病害易感，死亡率升高，眼柄切除親蝦產(chǎn)的卵孵化率不高或延遲，對(duì)后代產(chǎn)量產(chǎn)生影響。因此，從分子水平認(rèn)識(shí)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的作用機(jī)制，探討其卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)理，指導(dǎo)發(fā)展新的人工催熟技術(shù)，是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。本研究通過(guò)研究泛素融合蛋白UbL40基因（PmUbL40）克隆分析及其在斑節(jié)對(duì)蝦各組織和卵巢發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探明斑節(jié)對(duì)蝦卵巢的分子發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 斑節(jié)對(duì)蝦 從海南三亞海域收集不同發(fā)育階段的雌性斑節(jié)對(duì)蝦并暫養(yǎng)3 d。通過(guò)觀察斑節(jié)對(duì)蝦的顏色、外部形態(tài)和性腺顏色來(lái)初步確定對(duì)蝦的發(fā)育階段期，斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育期各3只取卵巢組織后立即液氮凍存，部分卵巢組織用 4%多聚甲醛保存用于切片制作已確認(rèn)卵巢發(fā)育時(shí)期分期［10］。

1.1.2 主要試劑 RNAlater、Trizol（Life Technologies公司），PrimeScriptRTReagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒、pMD18-T 載體、ExTaq酶、SYBR?Premix EX TaqTM（Perfect Real Time） 試劑盒、SMARTTMRACE cDNA kit（TaKaRa 公司）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（上海生工公司）。

1.1.3 引物 根據(jù)從斑節(jié)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到的PmUbL40基因片段，設(shè)計(jì)特異性引物，PmUbL40基因RACE引物（3'Race-F1：GGCTCAATTACACCACCACGCAG和3' Race-F2：TGCAGTTGTACTTTTCAGCCAAA AGC），PmUbL40基因開(kāi)放閱讀框驗(yàn)證引物（PmUbL40-F：TGTTTTGGGAAGAGGGAT和PmUbL40-R：CAAGACATTTAATACATGGTCC）；并設(shè)計(jì)PmUbL40基因定量引物（PmUbL40-qF：TTTGGCTGAAAAGTACAACTGCA和PmUbL40-qR：AGCTTCTTCTTGGGTCGGAT）和 E F 1 α 基因定量引物（E F 1 α-q F：TTCCGACTCCAAGAACGACC和EF1α-qR：GAGCAGTGTGGCAATCAAGC）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)Trizol說(shuō)明書提取斑節(jié)對(duì)蝦各組織（腦神經(jīng)、胸神經(jīng)、血淋巴、肌肉、腸道、心臟、肝胰腺和卵巢）及不同發(fā)育時(shí)期的卵巢組織總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，核酸微量定量?jī)xNanoDrop-2000檢測(cè)A260/A280比值和濃度，按cDNA合成試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SMART-RACE克隆基因cDNA全長(zhǎng) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出目的PmUbL40基因片段，運(yùn)用SMART-RACE方法，擴(kuò)增得到PmUbL40基因cDNA序列全長(zhǎng)。然后通過(guò)OFR Finder找的可能開(kāi)放閱讀框（OFR），并用開(kāi)放閱讀框驗(yàn)證引物擴(kuò)增驗(yàn)證確定該基因OFR的正確性。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、OFR Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）等在線軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，驗(yàn)證該目的基因并將其拼接得到該基因的全長(zhǎng)cDNA序列；SingnalP3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）查找可能的信號(hào)肽序列；使用（http：//cn.expasy.org/tools/pi_tool.html）預(yù)測(cè)基因的等電點(diǎn)及分子量；使用 NetPhos 2.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；使用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)域；使用 PSORT II Prediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)；利用MatGAT2.02（http：//ww3.bergen.edu/faculty/jsmalley/matgat.html）進(jìn)行序列相似性和一致性分析；利用BioEdit（http：//www.mbio.ncsu.edu/bioedit/）軟件進(jìn)行多重比對(duì)；利用Mega5.0 軟件（http：//www.megasoftware.net/）中的鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（Bootstrap=1 000）。

1.2.4 PmUbLL40基因在各組織及卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析 根據(jù)cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物PmUbL40-qF和PmUbL40-qR及內(nèi)參引物EF1α-qF和EF1α-qR。Real time-PCR的反應(yīng)體系為：20 μL體系中含10 μL SYBR Green I Real time PCR mix，10 μmol/L的引物F和引物R 各0.4 μL，2 μL cDNA第一鏈，用滅菌水補(bǔ)足，每個(gè)樣品cDNA及內(nèi)參分別做3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件為95℃ 1 min；95℃ 15 s、60℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。檢測(cè)PmUbL40和EF1α基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線。根據(jù)儀器分析得出各個(gè)樣品的CT值，通過(guò)計(jì)算獲得每個(gè)樣品的RQ值即 2-△△CT，其中△CT=各樣品目的基因的 CT值-內(nèi)參基因Ef1α的 CT值，△△CT=每一個(gè)樣品的△CT值-基準(zhǔn)樣品的△CT值，基因表達(dá)水平由 RQ平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來(lái)表示，SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PmUbL40基因全長(zhǎng)及cDNA序列分析

根據(jù)已知的斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組序列，利用RACE克隆得到斑節(jié)對(duì)蝦PmUbL40基因cDNA全長(zhǎng)序列571 bp（GenBank登錄號(hào)：KP641180），包括50 bp的5'UTR、131 bp的3'UTR，開(kāi)放閱讀框（ORF）為390 bp，編碼129個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為14.7 ku，等電點(diǎn)為9.76。SingnalP分析其預(yù)測(cè)氨基酸序列不含有信號(hào)肽序列。使用SMART預(yù)測(cè)氨基酸序列的氮末端（1～76aa）為高度保守的泛素結(jié)構(gòu)域，碳末端（77～129aa）為典型的核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域。NetPhos 2.0 Server對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析得到以下可能的磷酸化位點(diǎn)：1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（T22），2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（S57和S108），1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（Y89）。PSORT Ⅱ預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其細(xì)胞定位在細(xì)胞核內(nèi)（60.9%）。核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域中含有4個(gè)半胱氨酸殘基（C96、C99、C110、C115）構(gòu)成1個(gè)C2-C2型鋅指結(jié)構(gòu)，1個(gè)核定位序列（109NCRKKKCGH117）。

2.3 PmUbL40與其他物種UbL40序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MatGAT2.02將 PmUbL40的蛋白序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種的蛋白序列進(jìn)行序列相似性和一致性分析，并用Bioedit進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果（圖2）顯示，PmUbL40在物種進(jìn)化中高度保守，斑節(jié)對(duì)蝦與凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei，GenBank登錄號(hào)：AIJ28479）的UbL40蛋白序列相似性和一致性均達(dá)100%。

利用MEGA5.0軟件構(gòu)建PmUbL40和其他物種 U b的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖3）表明，PmUbL40與凡納濱對(duì)蝦、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，ADF45323）、豐年蝦（Artemia franciscana，ABS19964）聚為一支，親緣關(guān)系較近；脊椎動(dòng)物人類（Homo sapiens，NP_003324）、牦牛（Bos mutus，ELR54587）、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus，NP_001187064）、鯉魚（Cyprinus carpio，ABS32204）、斑馬魚（Danio rerio，NP_001032190）和大西洋鮭（Salmo salar，ACN09942）聚為一支；軟體動(dòng)物牡蠣（Crassostrea gigas，EKC19428）、光滑雙臍螺（Biomphalaria glabrata，AAG49552）聚為一支；海參（Holothuria glaberrima，AEB53190）和鹿角珊瑚（Acropora millepora，AAC47388）聚為一支。

圖1 PmUbL40全長(zhǎng) cDNA 序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 斑節(jié)對(duì)蝦PmUbL40與其他物種的Ub蛋白氨基酸序列比對(duì)

圖3 PmUbL40與其他物種UbL40氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 PmUbL40基因在不同組織中的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PmUbL40在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）顯示，PmUbL40在各組織中肝胰腺表達(dá)量最高，其次為肌肉和卵巢，其中肝胰腺與其他個(gè)組織表達(dá)差異顯著。

圖4 PmUbL40基因在不同組織中的表達(dá)

2.5 PmUbL40基因在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育各期中，PmUbL40在卵巢Ⅱ期的表達(dá)量最高，顯著高于其他期卵巢；其次為Ⅴ期，顯著高于卵巢I、III、IV期的表達(dá)量（圖5）。

圖5 PmUbL40基因在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

3 　討論

UPP途徑是生物體內(nèi)重要的蛋白降解途徑，是一個(gè)復(fù)雜、嚴(yán)密調(diào)控的過(guò)程，由Ub、E1、E2s、E3s、26S蛋白酶體等組分間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)降解蛋白的一種方式。本研究以斑節(jié)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得泛素融合蛋白L40（PmUbL40）基因片段，通過(guò)RACE方法克隆得到了PmUbL40的cDNA全長(zhǎng)序列，預(yù)測(cè)氨基酸序列含有1個(gè)高度保守的泛素結(jié)構(gòu)域和核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域，并含有1個(gè)C2-C2型鋅指結(jié)構(gòu)和1個(gè)核定位序列。序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各物種間UbL40氨基酸序列的相似性均達(dá)90%以上，表明各物種UbL40序列在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。通過(guò)對(duì)PmUbL40氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，該蛋白存在1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（T22）、2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（S57和S108）、1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（Y89），磷酸化位點(diǎn)作為信號(hào)傳導(dǎo)等調(diào)控分子的重要結(jié)構(gòu)，可以預(yù)測(cè)PmUbL40在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中起到廣泛的調(diào)控作用。PmUbL40蛋白由泛素結(jié)構(gòu)域和核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域兩部分組成，核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域參與核糖體60S大亞基的組裝，形式分子伴侶的功能。在這過(guò)程中，由特殊的肽鏈內(nèi)切酶識(shí)別泛素結(jié)構(gòu)域和核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域之間的酶切位點(diǎn)，將核糖體蛋白L40結(jié)構(gòu)域切下，釋放出泛素結(jié)構(gòu)域進(jìn)入U(xiǎn)PP途徑形式功能。

PmUbL40基因在斑節(jié)對(duì)蝦各組織的表達(dá)定量結(jié)果中顯示，在肝胰腺中表達(dá)量顯著高于其他各組織，其次為肌肉和卵巢，研究表明甲殼動(dòng)物的肝胰腺是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和儲(chǔ)存的重要器官，與甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖具有密切關(guān)系［11］，結(jié)果暗示了PmUbL40可能對(duì)于斑節(jié)對(duì)蝦的蛋白分解與利用具有一定作用。

本研究對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育不同時(shí)期中PmUbL40的表達(dá)結(jié)果顯示，卵巢發(fā)育Ⅱ期顯著高于其他各期，其次為Ⅴ期，顯著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ期。斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程主要包括卵子的形成和卵黃積累的過(guò)程。細(xì)胞周期在細(xì)胞分裂和配子形成過(guò)程中具有重要作用［12-13］，而在細(xì)胞周期過(guò)程中，各個(gè)發(fā)育時(shí)期的過(guò)度需要細(xì)胞周期蛋白激活并在下一個(gè)發(fā)育時(shí)期降解以便于細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)包括大多數(shù)的周期蛋白是通過(guò)UPP降解的［14］。卵巢發(fā)育Ⅰ期是卵原細(xì)胞期，主要以有絲分裂為主的卵原細(xì)胞的增殖，而此期PmUbL40基因表達(dá)相對(duì)較低，說(shuō)明該基因可能較少參與前期的細(xì)胞有絲分裂過(guò)程。卵巢發(fā)育Ⅱ期開(kāi)始卵原細(xì)胞的減數(shù)分裂以及卵黃合成的前期準(zhǔn)備，而此期PmUbL40大量表達(dá)，說(shuō)明PmUbL40可能參與卵巢發(fā)育減數(shù)分裂過(guò)程，以及可能對(duì)卵黃蛋白的形成起到調(diào)節(jié)作用。隨著卵巢發(fā)育的逐步成熟，卵巢發(fā)育即將開(kāi)始一個(gè)新的周期，此時(shí)成熟期（即發(fā)育Ⅴ期）卵巢PmUbL40表達(dá)較為升高。

UPP途徑中對(duì)甲殼動(dòng)物的性腺發(fā)育和配子發(fā)生具有重要作用，Zhang 等［15］在日本沼蝦中克隆了Ubc9基因，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了Ubc9基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Ubc9基因在卵巢發(fā)育早期表達(dá)較低，卵黃粒期時(shí)達(dá)到最大，而成熟期降至最低值，表明Ubc9基因可能在卵子發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色。戴燕彬等［16］篩選出泛素基因（Ubquitin）片段，其cDNA 序列全長(zhǎng)555 bp， 并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ub 在鰓中的表達(dá)水平最高，卵巢次之，各組織間的表達(dá)無(wú)顯著性差異，Ub在卵巢發(fā)育O5 期的表達(dá)水平最高，O1、O4 期次之，O2 期表達(dá)量最低且與 O5 期具有顯著差異，Ub在精巢發(fā)育T2 期的表達(dá)量最高，其次為 T1 期，T3 期表達(dá)最低且與 T2期具有顯著差異，表明Ub對(duì)于擬穴青蟹生殖細(xì)胞的發(fā)育可能具有重要作用。Wang等［17］利用RTPCR檢測(cè)了中華絨螯蟹EsSUMO-1 和EsUbc9基因分別在精巢和卵巢中的表達(dá)情況，結(jié)果EsSUMO-1 和EsUbc9基因在精巢Ⅱ-1階段表達(dá)適中，在Ⅱ-2階段增多，然后逐漸下降；在卵巢中，早期EsSUMO-1 和EsUbc9基因表達(dá)低，在Ⅲ-2階段表達(dá)量達(dá)到最大，在Ⅳ期逐漸降低，表明在中華絨螯蟹精卵子發(fā)生過(guò)程中EsSUMO-1 和EsUbc9基因可能具有重要作用。Shen等［18］采用退火控制引物技術(shù)從日本囊對(duì)蝦性腺中篩選出泛素綴合酶E2r基因并證明其在精巢中的表達(dá)水平高于卵巢，在精巢T2期的表達(dá)水平達(dá)到最高，而在卵巢O1表達(dá)最低，在卵巢O4和O5的表達(dá)值相近。Leelatanawit等［19］在斑節(jié)對(duì)蝦精巢cDNA文庫(kù)中找到許多精巢發(fā)育相關(guān)基因，如SUMO-1、泛素綴合酶E2等。Preechaphol等［20］在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢EST文庫(kù)中找到X染色體泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，X-linked，Usp9x），并對(duì)該基因在精卵巢不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明該基因在O5期表達(dá)水平達(dá)到最高值，而在精巢中T2期表達(dá)量最高，可能是精巢中大量生精細(xì)胞處于快速增殖期。本研究中，PmUbL40基因卵巢發(fā)育Ⅱ期的表達(dá)量最高，可能參與了卵巢組織中的卵母細(xì)胞的快速增殖。

綜上所述，本研究克隆了斑節(jié)對(duì)蝦PmUbL40基因的全長(zhǎng)cDNA序列并對(duì)基因序列，研究了PmUbL40基因在不同組織和卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)特征，為研究PmUbL40在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生可能具有重要作用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Molecular characterization and expression profiles of UbS27 gene from black tiger shrimp （Penaeus monodon）

FU Ming-jun1，2，WU Song1，3，TANG Lei1，4，ZHOU Fa-lin1，QIU Li-hua1，JIANG Shi-gui1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China；2.Tropical Aquaculture Research and Development Center of South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Sanya 572018，China 3.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；4.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Penaeus monodon ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein gene （PmUbL40） was identified and characterized by using an approach which combines the data of transcriptome and rapid amplification of cDNA end （RACE）.The expression profile of PmUbL40 in different development stages of the ovary and various tissues were determined by real-time quantitative PCR.The full length cDNA of PmUbL40 gene was of 390bp，which encoded a protein of 129 amino acids with estimated molecular mass of 14.7 ku and theoretical isoelectric point of 9.76.The encoded protein consists ubiquitin domain （1-76aa）and ribosomal L40 domain （77-129aa）.Real-time quantitative PCR results showed that PmUbL40 was expressed high in hepatopancreas than in other tissues.And PmUbL40 was expressed the highest in the ovary stay II，and than in ovary stage V，which indicated that PmUbL40 may play an important role in ovary development and oogenesis.

Penaeus monodon；ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein （UbL40）；ovary development；gene cloning

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.027

2015-04-04

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-47）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B040402016，2014A020208039）；海南省自然科學(xué)基金（20163147）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2014TS12）

傅明駿（1983-），男，博士，助理研究員，E-mail：fu.mj@163.com

江世貴（1964-），男，博士，研究員，E-mail：jiangsg@21cn.com

S917；Q786

A

1004-874X（2016）04-0144-07