樊　凌　趙蒨琦　呂愛平　許能貴　劉建華　李滋平　吳泰相　歐愛華　符文彬

(廣東省中醫(yī)院大針灸科，廣東　廣州　510120)

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針刺對抑郁癥大鼠海馬SNARE蛋白介導(dǎo)突觸前谷氨酸釋放的影響

樊凌趙蒨琦呂愛平1許能貴2劉建華李滋平吳泰相3歐愛華4符文彬

(廣東省中醫(yī)院大針灸科，廣東廣州510120)

〔摘要〕目的探討針刺對抑郁癥的治療作用及其可能的治療靶點(diǎn)。方法采用長期不可預(yù)見的溫和性刺激建立大鼠抑郁癥模型。成功造模后，給予利魯唑和針刺治療，觀察各組大鼠行為學(xué)的變化，測定海馬組織谷氨酸的含量變化；應(yīng)用Western印跡和熒光定量PCR檢測突觸小體相關(guān)蛋白(SNAP)-25、突觸小泡膜相關(guān)蛋白(VAMP)1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1蛋白及相應(yīng)mRNA表達(dá)。結(jié)果與空白組相比，應(yīng)激后大鼠的活動(dòng)能力、體重和蔗糖消耗量明顯下降(P<0.05)；海馬組織谷氨酸含量顯著升高(P<0.01)；而經(jīng)利魯唑和針刺治療后，活動(dòng)能力、體重和蔗糖消耗量升高；海馬組織谷氨酸含量下降。Western印跡和RT-PCR結(jié)果顯示：模型組大鼠的SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，利魯唑和針刺組均能降低SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1表達(dá)水平，且利魯唑組與針刺組對各檢測指標(biāo)的影響均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論針刺對谷氨酸釋放有明顯的調(diào)節(jié)作用，可溶性NSF附著蛋白受體(SNARE)介導(dǎo)的突觸前谷氨酸釋放在抑郁癥的發(fā)病以及針刺抗抑郁過程中有重要作用，可能是針刺抗抑郁的靶點(diǎn)之一。

〔關(guān)鍵詞〕針刺；抑郁癥；海馬；SNARE蛋白；谷氨酸

抑郁癥又稱抑郁障礙，病因復(fù)雜、臨床癥狀多樣。谷氨酸引起的興奮毒性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的共同分子機(jī)制。藥物治療和心理治療是目前抑郁癥治療的主要手段，比較常用的抗抑郁藥有單胺氧化酶抑制劑(MAOI)和三環(huán)類抗抑郁藥(TCA)，均為中樞神經(jīng)類藥物。利魯唑作為谷氨酸釋放抑制劑具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制多種受體和離子通道介導(dǎo)的谷氨酸突觸傳導(dǎo)和神經(jīng)元超興奮性，保護(hù)神經(jīng)元免受興奮毒性損傷〔1～3〕。本文通過不可預(yù)測的溫和性刺激建立抑郁癥大鼠模型，給予利魯唑灌胃和針刺后，觀察模型鼠的行為學(xué)改變、海馬組織谷氨酸含量、谷氨酸釋放相關(guān)的可溶性NSF附著蛋白受體(SNARE)表達(dá)水平的變化，探討針刺抗抑郁的可能分子機(jī)制及其作用靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體重180～220 g的成年SD雄性大鼠32只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑與儀器利魯唑片(法國安萬特制藥公司)；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國invitrogen公司)；抗突觸小泡膜相關(guān)蛋白(VAMP)1、抗VAMP2、抗VAMP7、抗突觸小體相關(guān)蛋白(SNAP)-25和anti-syntaxin1(美國Abcam公司)；熒光定量檢測試劑盒(廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司)。

Leica5001石蠟切片機(jī) (德國萊卡)；Image-Pro PlusM IS2000圖像分析系統(tǒng) (美國Media Cybernetics公司)；G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)；XSP-2C 光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽科大創(chuàng)新股份有限公司)；ABI 9700 PCR儀(美國ABI 公司)。

1.3造模方法采用長期不可預(yù)見性溫和刺激模型，共接受21 d各種不同的應(yīng)激，包括冰水游泳5 min、禁水24 h、禁食24 h、夾尾1 min、搖晃(1次/s，15 min)、晝夜顛倒、電擊足底(5 min/次)等刺激，每天隨機(jī)安排1種，平均每種刺激各進(jìn)行21次，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。

1.4實(shí)驗(yàn)分組成年雄性SD大鼠32只隨機(jī)分為空白組、模型組、針刺組(合谷+太沖)和利魯唑組，每組8只?？瞻捉M進(jìn)行正常飼養(yǎng)，不給予任何處理；模型組在造模后不給予其他處理；利魯唑組造模成功后，每天給予利魯唑灌胃(1.8 mg/kg，溶解于生理鹽水中)1次，持續(xù)21 d；針刺組造模后同時(shí)電針刺合谷和太沖穴(G6805Ⅱ型電針治療儀，疏密波，2～20 Hz，強(qiáng)度以肉眼可見大鼠肢體輕微顫動(dòng)為度)，1次/d，每次15 min，左右兩側(cè)穴位交替進(jìn)行，持續(xù)21 d。

1.5行為學(xué)觀察在治療前及治療后第7、14、22天，用曠場試驗(yàn)觀察各組大鼠行為(水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng) )的變化。以動(dòng)物穿越底面的塊數(shù)為水平活動(dòng)的得分?jǐn)?shù)，以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)的得分?jǐn)?shù)，每只動(dòng)物共進(jìn)行4次測定，每次3 min。在應(yīng)激第22天，觀察大鼠體重和24 h蔗糖溶液消耗量(即24 h飲用1% 蔗糖溶液量)的變化。

1.6海馬組織谷氨酸含量測定大鼠腹腔注射麻醉后處死，迅速分離出海馬組織，稱重，-80℃ 冰箱保存。待測海馬組織置勻漿器中，加適量90%乙醇冷凍環(huán)境下進(jìn)行勻漿，取上清液在 80℃水浴中蒸干除去乙醇，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定谷氨酸含量。色譜條件：Hypersil ODS 色譜柱，4.0×125 mm，粒徑5 μm；柱溫40℃；流動(dòng)相(A)：10 mmol/L Na2HPO4pH值7.2緩沖液(PB)；流動(dòng)相(B)：PB+甲醇+乙腈(50+35+15)；線性梯度：0～25 min，流動(dòng)相 B以線性從0%上升到100%。流量：1.0 ml/min。檢測波長：激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm。

1.7Western印跡檢測SNAP-25、VMAP1、VMAP2、VMAP7和syntaxin1蛋白水平利用組織裂解液裂解腦組織，然后進(jìn)行組織蛋白定量；取25 μg蛋白加入上樣緩沖液，沸水浴5 min后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，TBS溶液(含5%脫脂奶粉)4℃封閉過夜；封閉結(jié)束后，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)移至含目的抗體的Tris鹽酸緩沖液(TBS)，室溫2 h；1×TBS洗膜5 min×5次；加入二抗溶液，室溫孵育1 h；1×TBS洗膜5 min×5次；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒曝光并顯影。掃描顯影條帶，采用Phoretix 2D軟件進(jìn)行灰度值分析，以同一樣品的SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1與GAPDH條帶的灰度值比值作為SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1蛋白的相對含量。

1.8熒光定量PCR檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1 mRNA含量采用RNA提取試劑盒提取海馬組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定濃度及純度。參照定量PCR試劑盒操作說明，上述準(zhǔn)備的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。采用2倍SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為模板，20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測樣本設(shè)置3個(gè)平行，分別檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1基因，并以18S基因?yàn)閮?nèi)參照，三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。引物(上海生工生物合成)序列：SNAP-25正義-5′-GCAGGTGAGCGGCATCAT-3′，反義-5′-GCACGTTGGTTGGCTTCATC-3′；VAMP1正義-5′-GCGTCCCACATGCTTCTGACT-3′，反義-5′-GCGTGTTCCTGAGAGCCTGTT-3′；VAMP2正義-5′-GGTGGATGAGGTGGTGGACAT-3′，反義-5′-CGCTTGAGCTTGGCTGCACTT-3′；VAMP7正義-5′-GCCCAAGTGGACGAACTGAAAGG-3′，反義-5′-GGTGACGGACGAATCTACGAGGT-3′；syntaxin1正義-5′-GTGGAACACGCTGTGGACTAC-3′,反義-5′-CGATGGTGGAGGCGATGATGAT-3′;18S正義-5′-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCAT-3′,反義-5′-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3′。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件行LSD法檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察結(jié)果經(jīng)過21 d不可預(yù)測的溫和性刺激，大鼠表現(xiàn)出抑郁癥的行為學(xué)改變，包括運(yùn)動(dòng)量、體重和蔗糖消耗量均顯著下降。曠場試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)量均顯著下降。隨著利魯唑或針刺治療的進(jìn)行，抑郁癥大鼠的運(yùn)動(dòng)量逐漸增多；體重和蔗糖消耗量也有不同程度的恢復(fù)(P<0.05)。見表1，表2。

表1　曠場試驗(yàn)結(jié)果

表2　大鼠體重和蔗糖溶液消耗量的變化±s,n=8)

2.2海馬組織谷氨酸含量測定結(jié)果經(jīng)過21 d不可預(yù)測的溫和性刺激，海馬組織谷氨酸含量從空白組的(1.07±0.30)mg/g升高到模型組的(1.61±0.42)mg/g(P<0.05)。當(dāng)給予利魯唑治療或針刺處理后，其谷氨酸含量發(fā)生顯著性下降(P<0.05)，分別下降到(1.15±0.36)mg/g和(1.23±0.31)mg/g。

2.3Western印跡檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1蛋白水平與空白組相比，模型組SNAP-25蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，利魯唑組和針刺組的SNAP-25蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。其余四種蛋白的相對表達(dá)水平具有上述相似的變化趨勢。見圖1。

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下圖同圖1　各組大鼠谷氨酸循環(huán)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

2.4RT-PCR檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1 mRNA含量與空白組比較，模型組SNAP-25表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；當(dāng)模型組大鼠給予利魯唑或者針刺治療后，SNAP-25表達(dá)水平顯著下降，接近空白組的正常大鼠(P<0.05)。其余四種基因的表達(dá)趨勢與SNAP-25基因表達(dá)趨勢相似。見圖2。

圖2　各組大鼠谷氨酸循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá)變化

3討論

神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的基本過程，是生命活動(dòng)的基本事件之一，而突觸囊泡胞吐過程又是神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制中的一個(gè)核心問題。SNARE 核心復(fù)合物是突觸囊泡胞吐過程中的核心成分，而且參與幾乎所有分泌細(xì)胞的胞吐過程，其由三種蛋白質(zhì)組成：VAMP，突觸前膜上的蛋白syntaxin和SNAP-25〔4〕，受到不可預(yù)見的溫和性刺激后，VAMP蛋白、syntaxin蛋白和SNAP-25均發(fā)生顯著上調(diào)〔5〕。相反地，破傷風(fēng)毒素和肉毒神經(jīng)毒素可通過選擇性酶解不同SNARE 蛋白而抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放〔6〕，證明了SNARE 蛋白在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中的重要作用。

對抑郁癥病因病理學(xué)的傳統(tǒng)解釋主要集中于中樞神經(jīng)單胺類遞質(zhì)的功能失調(diào)上，然而，新的研究表明，除單胺神經(jīng)遞質(zhì)外，谷氨酸等也扮演了重要的角色〔7〕。谷氨酸作為一種中樞神經(jīng)遞質(zhì)，存在于海馬，尾狀核、下丘腦和小腦中。在前腦中，使用興奮性氨基酸的神經(jīng)元占總神經(jīng)元的30%以上，皮質(zhì)中也含有高密度的接受谷氨酸作用的神經(jīng)元。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的谷氨酸含量和活性顯著升高〔7〕。Reagan〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，大鼠給予不可預(yù)見的溫和性刺激處理后，谷氨酸含量顯著升高，海馬組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Ongur等〔9〕的“興奮性氨基酸學(xué)說”指出抑郁癥的病因?qū)W與谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用不可預(yù)見的溫和性刺激建立抑郁癥模型，應(yīng)激后大鼠呈明顯的活動(dòng)能力、體重和蔗糖消耗量下降，抑郁癥動(dòng)物模型建立成功。在調(diào)節(jié)谷氨酸釋放方面，針刺和抗抑郁藥物的療效相當(dāng)。對SNARE相關(guān)基因和蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，SNARE蛋白作為谷氨酸釋放的介質(zhì)，針刺和抗抑郁藥物均能引起其含量的變化。基于上述結(jié)果，本文認(rèn)為SNARE蛋白介導(dǎo)的突觸前谷氨酸釋放在抑郁癥的發(fā)病以及針刺抗抑郁過程中有重要作用，可能是針刺抗抑郁的靶點(diǎn)之一。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-12-19修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81303041)；中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.2012M511784)；廣東省教育廳高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012LYM_0043)；國家教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)新教師類專項(xiàng)科研基金(No.20124425120005)；中國博士后基金特別資助項(xiàng)目(No.2013T60793)；廣東省人社廳資助廣州中醫(yī)藥大學(xué)博士后研究人員科研基金(No.BBK429122K19)

通訊作者：符文彬(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，博士后合作教授，主要從事針灸治療疼痛及抑郁相關(guān)病癥的研究。

〔中圖分類號〕R2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3123-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.013

Effect of acupuncture on the release of presynaptic glutamate mediated by SNARE protein in hippocampus of rats with depression

FAN Ling, ZAHO Qian-Qi,Lü Ai-Ping,et al.

Department of Acupuncture and Moxibustion, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of acupuncture on depression and its related possible therapeutic target.MethodsDepressive disorder model was induced by exposure to chronic unpredictable stress using Sprague Dawley rats. Acupuncture stimulation and riluzole were used to treat the depressed rats. Behavior changes, hippocampucal glutamate content and glutamate-glutamine cycle related genes SNARE, were analyzed before and after therapy.ResultsCompared with the blank group, the rats showed horizontal or vertical movements, weight and sucrose consumption significantly decreased (P < 0.05), and the glutamate content in hippocampus was increased (P<0.05). After riluzole and acupuncture treatment, horizontal or vertical movements, weight and sucrose consumption were significantly increased (P<0.05), and the glutamate content in hippocampus was decreased. Western blot and RT-PCR showed that the expression of SNAP-25, VMAP7, VMAP1, VMAP2 and syntaxin1 in the model group were significantly higher than those of the blank group (P<0.05). Compared with the model group, riluzole and acupuncture could reduce the expression levels of SNAP-25, VMAP1, VMAP7, VMAP2 and syntaxin1，and there were no significant differences between the acupuncture and riluzole group(P>0.05).ConclusionsAcupuncture has a significant regulatory effect on glutamate release, SNARE protein mediated presynaptic release of glutamate plays an important role in depression, and it may be one of the targets of antidepression.

【Key words】Acupuncture; Depression; Hippocampus; SNARE protein; Glutamate

1香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院2廣州中醫(yī)藥大學(xué)

3中國循證醫(yī)學(xué)中心4廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院

第一作者：樊凌(1982-)，女，博士，中西醫(yī)結(jié)合博士后，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事針灸治療疼痛及抑郁相關(guān)病癥的研究。