王木森　孫春風(fēng)　柳雅玲

( 1.東阿縣人民醫(yī)院，山東 聊城　252201；　2. 泰山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 泰安　271000)

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微血管密度和血管生成擬態(tài)在子宮腺肌癥中的表達(dá)及意義*

王木森1孫春風(fēng)1柳雅玲2

( 1.東阿縣人民醫(yī)院，山東 聊城252201；2. 泰山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 泰安271000)

摘要：目的探討微血管密度和血管生成擬態(tài)在子宮腺肌癥中的表達(dá)及意義。方法選取我院2012年10月至2014年10月間組織病理確診子宮腺肌癥患者 40 例作為觀察組，再選取 40 例非子宮腺肌癥子宮切除患者作為對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué) S-P 法，用 CD31單克隆抗體對(duì)兩組患者進(jìn)行表達(dá)情況的標(biāo)記分析。采用特殊染色PAS觀察兩組患者血管生成擬態(tài)存在情況。結(jié)果在觀察組子宮腺肌癥異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和對(duì)照組內(nèi)膜組織中，CD31標(biāo)記的微血管密度分別為32.850、22.275和14.275.均數(shù)間經(jīng)兩兩比較的q檢驗(yàn)，任意兩組間比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 001) 。三組經(jīng)PAS染色，均未觀察到血管生成擬態(tài)。結(jié)論在子宮腺肌癥中，異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、對(duì)照組內(nèi)膜微血管密度依次降低。血管生成因素與異位內(nèi)膜侵襲能力有著較為密切的關(guān)系，可能是促進(jìn)子宮腺肌癥異位內(nèi)膜侵襲的重要因素。

關(guān)鍵詞：血管密度; 血管生成擬態(tài); 免疫組化

子宮腺肌病是婦科臨床工作中的常見疾病, 好發(fā)于30 ～ 50 歲的育齡期女性，其發(fā)病率在不同人群中差異較大，總體發(fā)病率為8%～62%[1-2]。子宮腺肌癥有類似惡性腫瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)模式，文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病與血管生成等因素有關(guān)[3]，血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)可能是毛細(xì)血管發(fā)生的早期事件[4]。本研究運(yùn)用免疫組化方法，從蛋白水平觀察微血管密度在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和對(duì)照組中大小，并用特殊染色PAS觀察血管生成擬態(tài)。本次研究選取我院 2012年10月至2014年10月間經(jīng)組織病理確診的子宮腺肌癥和非子宮腺肌癥患者子宮切除標(biāo)本各40例，分別作為觀察組和對(duì)照組，以探討血管生成因素在子宮腺肌癥異位內(nèi)膜侵襲性生長(zhǎng)中的促進(jìn)作用。現(xiàn)將研究情況報(bào)告如下。

1資料與方法

1. 1一般資料選取我院 2012年10月至2014年10月期間接收的全切子宮標(biāo)本80例，子宮內(nèi)膜均為增殖期狀態(tài)，并且均排除了子宮內(nèi)膜腫瘤性病變、卵巢惡性腫瘤，亦排除了其它嚴(yán)重的全身性疾病。入選病例所有患者年齡為39～55歲，平均年齡46.3歲，觀察組與對(duì)照組患者的年齡方面無差異，且患者術(shù)前3月均未服用過雌、孕激素類制劑治療。

1. 2方法將經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋的組織制成4μm的連續(xù)切片。選擇試劑: 即用型快捷免疫組化MaxVisionTM檢測(cè)試劑盒，鼠抗人CD31免疫組化單克隆抗體(克隆號(hào)JC/70A)。 嚴(yán)格按照染色程序，以說明書具體要求，依照步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照設(shè)計(jì):每一批切片均設(shè)有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。組織內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞為陽性內(nèi)對(duì)照，用免疫組化片組織內(nèi)背景作為陰性對(duì)照。CD31陽性著色模式為細(xì)胞膜染色，呈淺黃色至棕黃色顆粒狀，用于MVD計(jì)數(shù)。采用Weidner微血管密度計(jì)數(shù)法[5]:在低倍視野下(4×10)于微血管數(shù)量最密集區(qū)域(熱點(diǎn),hot spot)，選取5個(gè)高倍鏡視野(20×10),計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)微血管數(shù)(著色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞條索即標(biāo)記為 1條血管), 取其平均值。若管腔中內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目>8個(gè)或者有平滑肌束的厚壁血管計(jì)數(shù)時(shí)予以排除。糖原PAS染色陽性為沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的孔道、圖案樣結(jié)構(gòu)顯示深淺不一的紅色或紫紅色。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)結(jié)果均經(jīng)Excel數(shù)據(jù)庫整理，應(yīng)用SAS 9.1和PEMS統(tǒng)計(jì)軟件包處理。進(jìn)行F檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，組間的兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

CD31所標(biāo)記的微血管密度在實(shí)驗(yàn)組異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及對(duì)照組內(nèi)膜中的表達(dá)(見表1): 均數(shù)間經(jīng)兩兩比較的q檢驗(yàn)，任意兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。異位增殖期內(nèi)膜微血管密度高于在位增殖期內(nèi)膜；在位增殖期內(nèi)膜高于對(duì)照組增殖期內(nèi)膜；異位增殖期內(nèi)膜高于對(duì)照組內(nèi)膜。CD31所標(biāo)記的微血管密度異位內(nèi)膜>在位內(nèi)膜>對(duì)照組內(nèi)膜(圖1)。三組均未發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)(圖2)。

表1　MVD在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及對(duì)照組中的平均計(jì)數(shù)

均數(shù)間經(jīng)兩兩比較的SNK-q檢驗(yàn)，任意兩組間比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖1　CD31在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

圖2　糖原PAS染色在異位內(nèi)膜中陰性表達(dá)

3討論

子宮腺肌病之異位子宮內(nèi)膜的侵襲性生長(zhǎng)離不開血液供應(yīng)，因此研究人員推測(cè)微血管生成是子宮腺肌病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制之一[5-6]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者楊堯華等研究顯示，血管生成因素可能在子宮腺肌病發(fā)病過程中發(fā)揮著不可忽視的作用[7]。某些血管生成因子與抑制因子活性失去平衡，細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管基底膜的酶解，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分裂、出芽、遷徙，新的原始血管不斷分化成熟，最終形成新生毛細(xì)血管。該調(diào)節(jié)過程有眾多蛋白及細(xì)胞因子的參與，包括蛋白水解酶、透明質(zhì)酸酶、整合素家族、細(xì)胞因子和其它粘附分子等，其中血管生成有關(guān)因素起著至關(guān)重要的作用，包括與血管形成有關(guān)的指標(biāo)CD31、CD34，還有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)等，共同發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生成的作用[8]。

CD31與新生血管密切相關(guān)，是最常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物。其細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)敏感性與穩(wěn)定性均較強(qiáng)，并能更準(zhǔn)確的測(cè)定微血管密度。本研究結(jié)果顯示觀察組異位、在位子宮內(nèi)膜與對(duì)照子宮內(nèi)膜組織中均可見 CD31陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)小棕黃色顆粒，且主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)。通過對(duì)微血管密度的測(cè)定顯示，MVD 于實(shí)驗(yàn)組異位內(nèi)膜的測(cè)定水平顯著高于在位內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；且在位內(nèi)膜 MVD 水平亦顯著高于對(duì)照組內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。微血管密度的提高提示子宮腺肌病患者異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜具有顯著增強(qiáng)的血管生成潛在能力，且子宮內(nèi)膜異位至肌層后其血管生成能力較在位子宮內(nèi)膜亦顯著增強(qiáng)，并強(qiáng)于對(duì)照組子宮內(nèi)膜，更進(jìn)一步顯示子宮腺肌病患者，異位內(nèi)膜中微血管處于極其過度增生活躍狀態(tài)，以利于異位內(nèi)膜侵襲生長(zhǎng)，促使異位病灶進(jìn)一步增大。分析其與在位內(nèi)膜及對(duì)照組內(nèi)膜微血管密度，探討其可能的促微血管形成機(jī)理，阻斷微血管生成可能是治療子宮腺肌病的有效手段之一，為子宮腺肌病的臨床治療提供客觀理論依據(jù)。

血管生成擬態(tài)與常見的依賴內(nèi)皮細(xì)胞襯里的毛細(xì)血管不同， VM 是一種類似圖案樣、管狀的孔道，內(nèi)充有循環(huán)血液細(xì)胞，以滿足高侵襲性的腫瘤細(xì)胞對(duì)氧的需求。血管生成擬態(tài)存在時(shí)，惡性腫瘤細(xì)胞壞死不明顯，顯示VM存在區(qū)域的確有有效的血液供應(yīng)形式存在。在微環(huán)境中，腫瘤迅速增長(zhǎng)和血供不足會(huì)導(dǎo)致微環(huán)境缺氧，能夠引起缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-in -ducible factor，HIF-1α) 的過度表達(dá)，可以上調(diào)其下游基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，比如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A) 可通過VEGFR - 2激活ERK1/2，從而促進(jìn)VM的形成[9]; VEGF 還可造成腫瘤組織內(nèi)血管通透性升高，造成大量血漿蛋白滲出毛細(xì)血管外，為血管生成擬態(tài)的形成提供了暫時(shí)性基質(zhì)，也為新生毛細(xì)血管提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，VEGF 又能上調(diào)VE- cadherin 和EphA2的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致VM 的形成。

采用糖原PAS染色顯示血管生成擬態(tài)存在情況，文獻(xiàn)中多有報(bào)道[10-12]。糖原PAS染色顯示紫紅色的基底膜是最重要的VM判讀依據(jù)之一，但有時(shí) PAS染色陽性基底膜樣物質(zhì)可能會(huì)不連續(xù)，若存在紅細(xì)胞、血漿等成分亦支持是VM結(jié)構(gòu)。VM的形成通常是惡性腫瘤細(xì)胞通過自身變形和基質(zhì)重塑產(chǎn)生脈管樣通道,通道內(nèi)無血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆,通道外基底膜糖原PAS染色為陽性。子宮腺肌癥異位內(nèi)膜浸潤(rùn)性生長(zhǎng)模式類似惡性腫瘤，其是否存在血管生成擬態(tài)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)AM異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及對(duì)照組內(nèi)膜均未發(fā)現(xiàn)VM存在，可能與本組樣本量較少、實(shí)驗(yàn)方法或者選擇指標(biāo)不恰當(dāng)有關(guān)，也可能AM異位內(nèi)膜侵襲性依賴毛細(xì)血管生成，而沒有VM的形成。

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*作者簡(jiǎn)介：王木森(1975—)，男，山東東阿人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事臨床病理學(xué)工作。

通訊作者：柳雅玲

中圖分類號(hào)：R365

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2016)07-0754-03

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.07.008

(收稿日期2016-03-27)：

The expression and significance of microvascular density and angiogenesis mimicry in uterine adenomyosis

WANG Mu-sen1SUN Chun-feng1LIU Ya-ling2

(1.Dong'e People's Hospital, Liaocheng 252201，China; 2.Taishan Medical University, Taian 271000，China)

Abstract:Objective: To investigate the microvascular density and angiogenesis mimicry in the expression and significance of uterine adenomyosis.Methods: Forty patients with histopathologic diagnosis of uterine adenomyosis were selected as observation group in our hospital between 2012and October 10, 2014, then 40 cases of adenomyosis uterine hysterectomy patients were selected as control group.Using immunohistochemical S-P method, CD31monoclonal antibody expression of two groups of patients were analyzed.Special staining PAS was used to observe angiogenesis mimicry in both groups.Results: In the uterine adenomyosis ectopic endometrium and the lining in the endometrium in the observation group, and endometrial tissue in the control group in the organization, CD31markers of microvascular density were 32.850, 22.275and 14.275, respectively. The mean between the two in the q test showed that the comparison between the two groups was statistically significant (P < 0. 001).Angiogenesis mimicry was not observed in the three groups by PAS staining. Conclusion: In the uterine adenomyosis, ectopic endometrium, the lining in ectopic and microvascular density of the control reduced in turn.Angiogenic factors and ectopic endometrial invasive ability have a close relationship, which may be one of the important factors promoting ectopic endometrium invasion of uterine glands.

Key words:microvascular density; angiogenesis mimicry; immunohistochemical