王成龍，黃秋婷，戚　平（廣州市食品檢驗所（廣州市酒類檢測中心），廣東廣州 510410）

超高效液相色譜－四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法對酒中氨基甲酸乙酯確認分析的研究

王成龍，黃秋婷，戚平
（廣州市食品檢驗所（廣州市酒類檢測中心），廣東廣州 510410）

摘要：建立了Q Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜平行反應監(jiān)測測定氨基甲酸乙酯（EC）的方法。各類酒樣根據其基質差別，稀釋相對應倍數，過0.22 μm濾膜后，直接用高分辨質譜Q Exactive采集數據。以Poroshell 120 EC-C18色譜柱為分析柱，乙腈和0.1%（v/v）乙酸水為流動相，柱溫25℃，采用平行反應監(jiān)測（PRM）模式，提取目標化合物及其二級子離子的精確質量數定性定量。結果表明，方法在1～20 μg/L的范圍內線性關系良好（相關系數大于0.995），儀器檢出限（LOD）可達到0.05 μg/L，滿足各類酒樣中氨基甲酸乙酯的檢測要求。通過加標驗證，回收率范圍為92.3%～107.7%，相對標準偏差為0.6%～2.5%。實際樣品驗證，除啤酒外，其他類型酒樣均檢出了一定量的EC。該方法簡單、準確、高效，可作為快檢和確證檢測技術廣泛使用。

關鍵詞：超高效液相色譜； 靜電場軌道阱質譜； 氨基甲酸乙酯； 方法確證

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是食品在發(fā)酵和貯存過程中產生的化學污染物［1］，主要存在于酒精飲品（如黃酒、葡萄酒、烈酒等）、面包、醬油、奶酪等發(fā)酵制品中。早在1943年，Nettleship等［2］通過實驗證明了EC具有致癌作用。有研究表明，乙醇對氨基甲酸乙酯的致癌性有促進作用［3-4］。

我國是酒文化深厚的飲酒大國，日常烹飪對黃酒、料酒的需求量較大，此外還會大量消費酒精飲品佐餐。因此，研究快速準確分析酒中EC含量的檢測方法監(jiān)控我國酒精飲品中EC的含量，顯得尤為重要。

目前，我國對于飲料酒中氨基甲酸乙酯的測定，主要采用氣相色譜法［5］以及氣相色譜-串聯(lián)質譜法［6-7］，這兩種方法均需采用固相萃?。?-8］、液液萃?。?］等樣品凈化技術，使得前處理過程復雜繁瑣，有機溶劑用量較大，污染環(huán)境。近年來，有相關文獻報道用液相色譜串聯(lián)質譜法［10-12］檢測EC，但鑒于EC的相對分子質量較小，電離后只能選出1個特征子離子作為定性和定量離子［11-12］，易受干擾，不滿足歐盟關于食品或水中化合物方法鑒定點的要求［13］。且串聯(lián)質譜分辨率較低，仍需通過昂貴的內標化合物EC-D5來克服基質干擾問題［12］。

本實驗采用Q Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜平行反應監(jiān)測（PRM）模式：通過四級桿濾過EC化合物，碎裂后對高分辨的二級子離子專屬定量。該方法用提取到一級質譜和二級質譜的精確質量數定性定量，不易出現(xiàn)假陽性，且滿足方法確證中關于鑒定點的要求［13］。樣品經過稀釋直接進樣分析，高效簡便。實驗探索出不同類型酒進樣的最佳稀釋比例，在克服基質離子抑制效應的同時，達到較高的方法檢出能力。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

酒樣：市售。

儀器設備：高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀Q-Exactive（美國ThermoFisher公司）；Ulti-Mate 3000超高效液相色譜儀（美國ThermoFisher公司）；2600TH超聲波清洗器（上海安譜儀器公司）；Synergy超純水機系統(tǒng)（法國millipore公司）；0.22 μm水相濾膜（上海安譜儀器公司）。

試劑：氨基甲酸乙酯（EC）（純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；氨基甲酸乙酯內標（EC-D5）（純度98%，加拿大Toronto research chemicals公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國ThermoFisher公司）；冰乙酸（分析純，廣州化學試劑廠）；實驗用水為去離子水。

1.2標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg（精確至0.1 mg）EC和EC-D5 于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100 mL，分別配制成100 mg/L的標準儲備液，置于4℃冰箱中保存。根據使用狀況用去離子水逐級稀釋成適當濃度的標準工作液。

1.3樣品前處理方法

將酒樣搖勻（氣泡酒、啤酒需先劇烈振蕩脫氣），用分析天平稱取1 g（精確至0.1 mg）酒樣至適當規(guī)格的容量瓶（規(guī)格由稀釋體積決定），加入去離子水，超聲混勻，定容至刻度，經0.22 μm水相濾膜過濾后，上機測定。

不同基質類酒需經水稀釋以排除基質效應干擾。以1 g酒樣為基準，排除基質效應干擾所需的最低稀釋體積：白蘭地、威士忌、白酒5 mL，配制酒、紅酒、啤酒10 mL，黃酒25 mL。

1.4儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（3.0×100 mm，2.7 μm）；流動相：A相為0.1%乙酸水（v/v），B為乙腈，等度洗脫（95%A+5%B，體積比）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25℃；進樣體積：10 μL；分析時間：7 min。

1.4.2質譜條件

離子源溫度：350℃；傳輸金屬毛細管溫度：320℃；噴霧電壓：3000 V（正離子模式）；掃描范圍：m/z 50～750；一級質譜全掃描分辨率（R）：7000；C-trap最大容量（AGC target）：1×106；C-trap最大注入時間：50 ms；平行反應監(jiān)測二級子離子全掃描（PRM）分辨率（R）：17500；階躍式碰撞能（stepped NCE）：35%±15%；二級C-trap最大容量：2×105；二級C-trap注入時間：100 ms；化合物分子量較少，選取一個特征子離子作為定性和定量離子，其精確質量數及保留時間見表1。

表1　EC和EC-D5的分子式、精確質量數及保留時間

2　結果與討論

2.1樣品前處理條件的優(yōu)化

酒類樣品基質相對簡單，利用高分辨質譜的高選擇性和高靈敏性特點可直接進樣分析，但樣品基質會對電噴霧離子化產生抑制效應，造成定量結果偏離。高倍稀釋樣品雖然可減輕基質效應，但同時降低方法的檢出能力。而應用EC-D5內標校正又會使方法經濟成本過高。綜上考慮，選取各類基質酒樣能排除基質干擾的最小稀釋倍數后，以去離子水定容，以此兼顧結果的準確性及方法檢出限。

以逐級稀釋的各類酒樣基質為定容溶劑，與同比例下，去離子水稀釋的該目標化合物峰面積相比較，得出面積百分比比值。由于酒樣有EC本底值，故以EC的內標化合物來進行峰面積比對，結果見圖1。

2.2檢測條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件優(yōu)化

圖1　典型酒樣的稀釋比例對目標物峰面積的影響

圖2　EC和EC-D5于PRM模式下色譜圖

2.2.1.1流動相的選取考慮

氨基甲酸乙酯為一種有機堿，在正離子模式下，流動相呈酸性時，可提高其離子化效率和靈敏度，同時改善出峰峰形［14］。本實驗分別考察（10 mM）乙酸銨緩沖液、0.1%（v/v）乙酸水、0.1%（v/v）甲酸水作流動相下EC的出峰。結果表明，乙酸銨緩沖液用作流動相時出峰拖尾嚴重，而當流動相為0.1%乙酸水，EC的峰面積又比甲酸水時提高了50%。鑒于EC化合物極性強，最終采用0.1%乙酸水-乙腈（95+5）混合溶劑作為流動相。

2.2.1.2色譜分析柱的選擇

在0.1%乙酸水-乙腈流動相體系下考察了SHIMPACK XR-ODS（3.0×75 mm，2.2 μm）、KINETEX C18（2.1× 100 mm，2.6 μm）以及Poroshell 120 EC-C18（3.0×100 mm，2.7 μm）對EC的分離效果，發(fā)現(xiàn)只有Poroshell 120對EC有一定程度的保留，故本實驗選擇該色譜柱用于分析。

2.2.1.3柱溫條件的控制

EC化合物的保留時間受柱溫影響嚴重。隨著柱溫的提升，保留時間大幅減小。40℃的柱溫條件下，1.7 min出峰，當降低到30℃時，保留時間為3.0 min。為避免目標物過早出峰被樣品中的強極性雜質干擾，實驗柱溫嚴格設定為25℃，使EC穩(wěn)定于4.35 min出峰。

EC及EC-D5標準化合物平行反應檢測（PRM）模式下色譜圖見圖2。

2.2.2質譜條件優(yōu)化

EC的準分子離子峰為［M+H］+（m/z 90.05496），目標物相對分子質量較小，結構簡單，得到1個較明顯的特征碎片離子（m/z 62.02379），其作為定性及定量離子。根據精確質量數質量差，可以初步斷定該碎片離子由α-裂解，發(fā)生麥氏重排反應，丟失C2H4基團產生的，與Park等報道結果一致［15］。如采用普通低分辨質譜鑒定該方法時，一個母離子加一個子離子總鑒定數只有2.5，不符合歐盟委員會決議［13］關于食品或水中化合物方法確證鑒定點數≥3的基本要求，相比之下高分辨質譜鑒定點數則達到了4.5。

采取PRM平行反應監(jiān)測模式實現(xiàn)高通量的結果分析。與普通全掃描模式相比，PRM在定量分析上有更好的重現(xiàn)性。此外，對于EC這類小分子化合物，碰撞能設為階躍式，即在35%能量基礎上加減15%，即有3個碰撞能量對目標物進行碰撞，最終加和獲得二級譜圖，其更利于方法的定性確認。

2.3方法學評價

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

將目標物標準儲備液用去離子水稀釋，分別配制成EC含量為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L的標準工作液，按1.4節(jié)所述的色譜-質譜條件進行測定，計算峰面積，用最小二乘法進行回歸分析，得到在1～20 μg/L線性范圍內EC的線性回歸方程為y=-45008.9+ 112311x（y：EC峰面積，x：EC濃度）（r2=0.9993）；以信噪比為3確定檢出限（LOD值）為0.05μg/L，以信噪比為10確定定量限（LOQ值）為0.17 μg/L。

2.3.2精密度和回收率

不同基質類酒分別選取一個典型酒樣添加EC，低濃度水平加標選擇10 μg/kg，高濃度水平選擇200 μg/kg，以上2個濃度水平按1.3節(jié)和1.4節(jié)所述實驗步驟和條件進行處理測定，重復6次，計算方法回收率以及相對標準偏差。結果見表2。

2.4實際樣品的測定

對從市場上購買的6種不同基質類型的酒樣進行了檢測，每個樣品重復測定6次，除啤酒外，其他酒樣均檢出了一定量的EC。結果見表3。

3　結論

建立了Q Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜平行反應監(jiān)測測定EC的方法，具有前處理步驟簡單、分析時間短、環(huán)境友好等優(yōu)點。Q Exactive平行反應監(jiān)測掃描模式同時篩取母離子以及碎裂后子離子的精確質量數，與國標［16］相比，低檢出限、高準確性的特點大幅提升了方法的檢出能力，同時彌補了傳統(tǒng)串聯(lián)四級桿質譜測定小分子化合物易出現(xiàn)假陽性的缺點。

對于精確質量數，母離子的鑒定點是2，二級質譜分析，其總鑒定點可達4.5，可以對化合物進行確證分析［13］。本文中的EC測定方法可作為快檢和確證檢測技術廣泛使用。

表2　典型酒樣中EC的測定相對標準偏差及加標回收率（n=6）

表3　市售酒中EC的檢測結果（n=6）

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優(yōu)先數字出版時間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1428.012.html。

中圖分類號：TS261.7；TS262.3；O658

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0112-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016059

基金項目：廣州市民生科技重大專項“酒中致癌物氨基甲酸乙酯快速檢測及試劑盒研究與開發(fā)應用”項目（201300000079）。

收稿日期：2016-02-26

作者簡介：王成龍（1991-），男，助理工程師，工科學士，主要研究方向為食品檢驗，E-mail：403627757@qq.com。

通訊作者：戚平（1981-），男，高級工程師，博士，研究方向為食品檢驗，E-mail：gzsp2000@163.com。

Determination and Identification of Ethyl Carbamate in Alcoholic Drinks by UPLC-Quadrupole/Electrostatic Field Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometry

WANG Chenglong，HUANG Qiuting and QI Ping
（Guangzhou Food Inspection Institute，GuangzhouAlcoholic Drinks Inspection Center，Guangzhou，Guangdong 510410，China）

Abstract：A new method for the direct determination of ethyl carbamate in alcoholic drinks by UPLC-Quadrupole/Orbitrap high-resolution MS had been developed.Various alcoholic drinks were diluted properly according to their matrices with distilled water.After the filtration through 0.22 μm microporous membrane，ethyl carbamate was analyzed by high-resolusion mass spectrometry in positive mode.Chromatographic analysis was carried out using a poroshell EC-C18 column with acetonitrile and 0.1%（v/v）acetic acid aqueous solution as the mobile phase.In addition，the column temperature was set at 25℃.Ethyl carbamate was determined in the mode of parallel reaction monitoring（RPM）.Accurate mass-to-charge ratio extraction of the target compound ion and its fragmentation ion were utilized to further improve the accuracy of qualitative and quantitative analysis.The calibration curve showed good linearity in the range of 1～20 μg/L with the correlation coefficient over 0.995. The limit of detection（LOD）reached up to 0.05 μg/L.The recoveries of ethyl carbamate was in the range of 92.3%～107.7%.The relative standard deviations（RSD）was 0.6%～2.5%.The application indicated that almost all the alcoholic samples contained EC more or less except beer.The proposed method was easy，fast，sensitive and suitable for the determination and confirmation of ethyl carbamate in different kinds of alcoholic drinks.

Key words:ultra performance liquid chromatography（UPLC）；electrostatic field orbit trap mass spectrometry；ethyl carbamate；identification method