李　輝，陳　碧，鄒　輝，舒　玲，曹建國，張堅(jiān)松

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，郴州423000；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙　410013）

蔓荊子總黃酮抑制肝細(xì)胞癌球形成與激活A(yù)MPK抑制AKT相關(guān)

李輝*1，陳碧*1，鄒輝2，舒玲2，曹建國2，張堅(jiān)松2

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，郴州423000；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙410013）

【摘要】目的：研究蔓荊子總黃酮（FVTF）抑制人肝細(xì)胞癌自我更新作用及其機(jī)制是否涉及AMPK/Akt信號(hào)傳導(dǎo)。方法：腫瘤球形成法測(cè)定FVTF對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721和MHCC97H細(xì)胞系球形成率的影響。Westernblot分析FVTF處理SMMC-7721細(xì)胞AMPK和Akt磷酸化水平。結(jié)果：FVTF顯著降低SMMC-7721和MHCC97H細(xì)胞系球形成率，呈濃度依賴性。不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/mL）處理SMMC-7721細(xì)胞24h，AMPK磷酸化水平增高；Akt磷酸化水平下降。結(jié)論：FVTF抑制肝細(xì)胞癌自我更新作用與其激活A(yù)MPK抑制Akt活性相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】蔓荊子總黃酮；肝細(xì)胞癌；自我更新；AMPK；Akt

1997年Bonnet等首次從急性髓系白血病患者骨髓中分離并證實(shí)腫瘤干細(xì)胞（cancerstemcells，CSCs）的存在以來，越來越多的證據(jù)表明腫瘤中存在一小群具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞，表現(xiàn)出自我更新、多向分化和高致瘤性的特性，是維持腫瘤發(fā)生、生長和腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源［1，2］。蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL.v.ar1simplicifoliaCham.或蔓荊Vitextrifolia L.的干燥成熟果實(shí)，是載入中國藥典的一種傳統(tǒng)中藥，具有消熱解表、利濕解毒、止咳祛痰、緩解支氣管痙攣等癥狀的作用［3］。蔓荊子總黃酮（FructusViticisTotal Flavonoids，F(xiàn)VTF）是自主創(chuàng)制的一種具有靶向抑制腫瘤干細(xì)胞作用的蔓荊子有效部位（國家發(fā)明專利號(hào)：ZL201210591146.9）。本文的研究目的是檢測(cè)FVTF抑制人肝細(xì)胞癌自我更新作用并探討其機(jī)制是否涉及AMPK/Akt信號(hào)傳導(dǎo)。

1　資料與方法

1.1試劑和細(xì)胞系蔓荊子總黃酮（FVTF）根據(jù)專利說明書（國家發(fā)明專利號(hào)：ZL201210591146.9）從蔓荊子中提取和制備。FVTF的性狀為棕褐色粉末。FVTF按干燥品計(jì)算，總黃酮量以蘆丁計(jì)等于53%。高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）和磷酸緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司?？笰MPK、p-AMPK、Akt和p-Akt抗體均系美國Cell signaling公司產(chǎn)品。抗β-actin抗體來自美國Sigma Aldrich公司。人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系和MHCC97H細(xì)胞系分別購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海市）和上海復(fù)祥生物科技有限公司（中國上海市）。細(xì)胞在含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素G和100μg/mL鏈霉素的高葡萄糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，置37°C、飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中單層貼壁生長。

1.2球形成率測(cè)定按照先前文獻(xiàn)［4，5］描述的方法測(cè)定不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/mL）處理48h的球形成率。

1.3Westernblot按照先前發(fā)表文獻(xiàn)［5］的方法進(jìn)行westernblot分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Spss15.0for windowsevaluation軟件建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用OneWayANOVA方差分析；首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，在方差齊性時(shí)，多組均數(shù)比較采用LSD法；在方差不齊時(shí)，多組均數(shù)間比較采用Tukey's檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1FVTF對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞自我更新能力的影響球形成率測(cè)定結(jié)果顯示，F(xiàn)VTF以濃度依賴方式降低人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞（圖1A）和MHCC97H細(xì)胞（圖1B）的腫瘤球形成率（P＜0.05）。

圖1　FVTF抑制肝細(xì)胞癌腫瘤球形成（Mean±SD，n=3）A：肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞；B：肝細(xì)胞癌MHCC97H細(xì)胞。與溶媒對(duì)照組比較，*P＜0.05；與1.0　μg/mL　FVTF處理組比較，#P＜0.05。

2.2FVTF對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞AMPK磷酸化的影響免疫印跡分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VTF增高人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平。

圖2　FVTF增高SMMC-7721細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平

2.3FVTF對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞Akt蛋白磷酸化水平的影響免疫印跡分析結(jié)果證明，F(xiàn)VTF降低人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞Akt蛋白磷酸化水平。

圖3　FVTF降低SMMC-7721細(xì)胞Akt蛋白磷酸化水平

3　討論

FVTF是我們創(chuàng)制的一種具有靶向抑制腫瘤干細(xì)胞作用的蔓荊子有效部位（國家發(fā)明專利號(hào)：ZL201210591146.9）。為了驗(yàn)證FVTF是否具有抑制人肝細(xì)胞癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性作用，在本研究中，我們采用球形成率測(cè)定法檢測(cè)不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/ mL）對(duì)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721和MHCC97H細(xì)胞系細(xì)胞腫瘤球形成的影響。結(jié)果證實(shí)：FVTF以濃度依賴方式降低上述兩種細(xì)胞系球形成率。從而說明FVTF具有抑制體外培養(yǎng)肝細(xì)胞癌自我更新作用。

鑒于FVTF中的有效成分紫花牡荊素能通過促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞活性氧生成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6-8］，我們推測(cè)FVTF可能通過變動(dòng)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞特有的有氧糖酵解代謝性質(zhì)發(fā)揮抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞自我更新作用。最近的研究表明，靶向腫瘤細(xì)胞代謝是一種可供選擇的腫瘤治療方法。AMPK是一個(gè)關(guān)鍵性的能量傳感器，調(diào)控正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的新陳代謝［9，10］。據(jù)此，我們尋求檢測(cè)FVTF是否通過激活A(yù)MPK抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞自我更新作用。本文的Westernblot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VTF能有效增高AMPK蛋白磷酸化水平。這些結(jié)果建議FVTF抑制體外培養(yǎng)肝細(xì)胞癌腫瘤球形成至少部分是由于其增強(qiáng)AMPK活性所致。

有研究報(bào)道AMPK是調(diào)節(jié)二甲雙胍抗腫瘤作用的關(guān)鍵分子，并認(rèn)為AMPK介導(dǎo)抑制Akt起關(guān)鍵作用［11，12］。在本研究中，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)，不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/mL）處理，在增高AMPK蛋白磷酸化水平的同時(shí)，伴隨著Akt蛋白磷酸化水平的逐漸下降。這些結(jié)果首次表明AMPK/Akt信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)在FVTF抑制肝細(xì)胞癌球形成中的作用?，F(xiàn)在仍不明確AMPK/Akt信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)是否僅在FVTF抗肝細(xì)胞癌或肝癌干細(xì)胞中起作用，要明確這一點(diǎn)需要進(jìn)一步研究，并描述該信號(hào)級(jí)聯(lián)在其他人腫瘤干樣細(xì)胞和非干樣細(xì)胞中是否起作用。

參考文獻(xiàn)

［1］ Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell［J］. Nat Med, 1997, 3（7）: 730-737.

［2］ Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research［J］. Blood, 2008, 112（13）: 4793-4807.

［3］ 王雪莉, 曹曉誠, 盛習(xí)鋒, 等. 紫花牡荊素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞系干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新的影響［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2013（3）: 11-14.

［4］ Quan MF, Xiao LH, Liu ZH, ET AL. 8-bromo-7-methoxychrysin inhibits properties of liver cancer stem cells via downregulation of β-catenin［J］. World J Gastroenterol, 2013, 19（43）: 7680-7695.

［5］ Ren KQ, Cao XZ, Liu ZH, ET AL. 8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling［J］. Int J Oncol, 2013, 43（5）: 1719-1729.

［6］ Chen D, Cao J, Tian L, et al. Induction of apoptosis by casticin in cervical cancer cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial signaling pathways［J］. Oncol Rep, 2011, 26（5）: 1287-1294.

［7］ Zeng F, Tian L, Liu F, Cao J, et al. Induction of apoptosis by casticin in cervical cancer cells: reactive oxygen species-dependent sustained activation of Jun N-terminal kinase［J］. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai）. 2012, 44（5）: 442-449.

［8］ He L, Yang X, Cao X, et al. Casticin induces growth suppression and cell cycle arrest through activation of FOXO3a in hepatocellular carcinoma［J］. Oncol Rep, 2013, 29（1）: 103-108.

［9］ Kim YH, Liang H, Liu X, et al. AMPKalpha modulation in cancer progression: multilayer integrative analysis of the whole transcriptome in Asian gastric cancer［J］. Cancer Res, 2012, 13（10）: 2512-2521.

［10］ Din FV, Valanciute A, Houde VP, et al. Aspirin inhibits mTOR signaling, activates AMP-activated protein kinase, and induces autophagy in colorectal cancer cells［J］. Gastroenterology. 2012, 13（7）: 1504-1515.

［11］ Aljada A, Mousa SA. Metformin and neoplasia: Implications and indications［J］. PharmacolTher. 2012, 133: 108-115.

［12］ Sato A, Sunayama J, Okada M, et al. Glioma-initiating cell elimination by metformin activation of FOXO3 via AMPK［J］. Stem Cells Transl Med, 2012, 1（11）: 811-824.

【中圖分類號(hào)】R734.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-016X（2016）03-0005-03

收稿日期：2016-01-10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（No.30760248）；湖南省科技廳社發(fā)領(lǐng)域科技重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2015SK2066）；郴州市科技局科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.cz2015007）

通訊作者：張堅(jiān)松，E-mail：jwc_zjs@126.com

Inhibition of sphere-forming rate of hepatocellular carcinoma cellsby FructusViticis Total Flavonoids is associated with activation of AMPK and suppression of Akt

Li Hui1, Chen Bi1, Zou Hui2, Shu Ling2, Cao Jian-guo2, Zhang Jian-song2
（1. Department of pharmacy, The First People Hospital of Chenzhou, Changsha 432000, China；2. Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China）

［Abstract］Objective To investigate FructusViticis Total Flavonoids（FVTF） inhibits self-renewal capability of human hepatocellular carcinoma cells and the mechanism by which is involved in regulation of AMPK/Akt signaling. Methods Tumorsphere formation assay was used to determine the effects of FVTF on sphere forming rate of hepatocellular carcinoma SMMC-7721 and MHCC97H cell lines. Western blot was emploied to analyze the phosphorylation levels of AMPK and Akt proteins of SMMC-7721 cells treated with FVTF. Results FVTF significantly lowered the sphere forming rates of SMMC-7721 and MHCC97H cell lines, in a concentration-dependent manner. Treatment with various concentrations of FVTF（1.0、2.0 、4.0 μg/mL） for 24 h, the phosphorylation level of AMPK was elevated and the phosphorylation level of Akt was reduced in SMMC-7721 cells. Conclusion FVTF inhibits self-renewal capability of hepatocellular carcinoma cells is associated with activation of AMPK and suppression of Akt.

［Key words］fructus viticis total flavonoids； hepatocellular carcinoma； self-renewal； AMPK； Akt