王　倩，張　靜，張麗茹，王喜潔，朱金玲，崔繼文

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007; 2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

?

MCF-7細(xì)胞核的電化學(xué)行為研究①

王倩1，張靜1，張麗茹1，王喜潔1，朱金玲2，崔繼文1

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007; 2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：研究人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)細(xì)胞核的電化學(xué)行為，為拓展細(xì)胞電化學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。方法：采用單線掃描伏安法研究MCF-7細(xì)胞核的電化學(xué)行為，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核提取結(jié)果，采用高效液相色譜法分析了細(xì)胞核中的嘌呤堿基。結(jié)果：MCF-7細(xì)胞核在MWCNTs-IL/GCE上出現(xiàn)兩個氧化峰，分別歸因于黃嘌呤與鳥嘌呤的氧化反應(yīng)和腺嘌呤與次黃嘌呤的氧化反應(yīng)。結(jié)論：MCF-7細(xì)胞核中的嘌呤堿基在MWCNTs-IL/GCE上具有較好的電化學(xué)響應(yīng)，該電化學(xué)法有可能用于細(xì)胞核內(nèi)嘌呤的檢測。

關(guān)鍵詞：MCF-7；細(xì)胞核；MWCNTs-IL/GCE；單線掃描伏安法

近年研究表明細(xì)胞內(nèi)具有電化學(xué)活性物質(zhì)，采用循環(huán)伏安法測試能夠得到較好的電化學(xué)信號，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的細(xì)胞電化學(xué)，雖然歷史較短，但卻因其具有簡單、快速、靈敏度高、費用低等優(yōu)點，從而在生物分析領(lǐng)域受到極大的重視；然而目前對于細(xì)胞伏安響應(yīng)的研究還僅限于對于完整細(xì)胞的電化學(xué)響應(yīng)的探討[1～6]，對于細(xì)胞內(nèi)部各種細(xì)胞器的電化學(xué)響應(yīng)的研究目前還沒有開展，而這方面的研究對于細(xì)胞電化學(xué)進(jìn)一步的應(yīng)用具有極為重要的意義，故本文以人乳腺腫瘤細(xì)胞(MCF-7)為模型細(xì)胞，研究其細(xì)胞核的電化學(xué)響應(yīng)，為拓展細(xì)胞電化學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；HH.CP-T型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Olympus倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；安捷倫1100高效液相色譜儀系統(tǒng)，美國安捷倫科技(中國)有限公司；人乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7，東北林業(yè)大學(xué)贈送；普利萊細(xì)胞核包漿制備試劑盒(含有核提取試劑與胞漿提取試劑)，北京普利萊公司；Janus Green B(吉姆薩染液)，次黃嘌呤，黃嘌呤，鳥嘌呤，腺嘌呤，Sigma公司；多壁碳納米管(MWCNTs)，深圳納米港有限公司；離子液體(IL)，J&K Chemical Ltd.；優(yōu)級胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、雙抗(鏈霉素和青霉素)，Gibco公司；其余試劑均為分析純。

1.2電化學(xué)檢測

本實驗采用三電極體系作為電化學(xué)測試系統(tǒng)，其中多壁碳納米管和離子液體復(fù)合修飾玻碳電極(MWCNTs-IL/GCE)為工作電極，Ag/AgCl絲為參比電極，Pt絲為輔助電極，采用單線掃描伏安法進(jìn)行檢測，伏安掃描范圍為0.0～+1.1V，掃速為0.05V·s-1，通常掃描兩次，一般情況采集第一次的數(shù)據(jù)。除特殊說明外，測定均在室溫條件下進(jìn)行，測定前需要在電位+0.0V下富集360s。每次電化學(xué)測定結(jié)束后，MWCNTs-IL/GCE均在pH 7.4 PBS溶液中循環(huán)伏安掃描5圈，重新得到穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好的更新電極，可用于新的測試；而如果電極跑出的背景無法重合，不斷變小，說明電極無法繼續(xù)使用，需要重新制作新的電極。

1.3MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，于37℃恒溫、5% CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)皿面積達(dá)80 %的貼壁時，用適量的0.25%胰蛋白酶消化，放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中消化至胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，加適量DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

將生長狀態(tài)良好且長滿培養(yǎng)皿底的細(xì)胞依次按0.25%胰蛋白酶消化、吹打懸浮、離心(1000r·min-1，10min)后得細(xì)胞沉淀，所得細(xì)胞沉淀用pH 7.4 PBS溶液沖洗3次，然后用適量的pH 7.4 PBS溶液配成細(xì)胞懸液并計數(shù)，取一部分細(xì)胞懸液在水浴50℃作用30min后得到MCF-7細(xì)胞裂解液進(jìn)行電化學(xué)測定，剩余的細(xì)胞懸液留置備用。

1.4細(xì)胞核的提取及破碎

將上一步收集備用的細(xì)胞懸液，離心洗滌，在普利萊細(xì)胞核包漿制備試劑盒中取出2mL胞漿提取試劑加入到細(xì)胞懸液中，振蕩重懸細(xì)胞，冰浴2min，將細(xì)胞懸液移至冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)，上下研磨細(xì)胞30次，將混合物移至1.5mL離心管，在800×g，4℃離心分離5min，取管底沉淀加入1mL普利萊細(xì)胞核包漿制備試劑盒中的核提取試劑，振蕩重懸，在4000×g，4℃再次離心5min，棄上清，得到粗制細(xì)胞核；重復(fù)離心、洗滌一次得純凈細(xì)胞核；將所提取的純凈細(xì)胞核加入蛋白酶K 30min后，得細(xì)胞核破碎后溶液，用于電化學(xué)檢測和HPLC檢測。

1.5高效液相(HPLC)檢測

將細(xì)胞核破碎溶液進(jìn)行HPLC檢測，進(jìn)樣量為20μL，并與4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品混合物的液相圖譜作對照。色譜條件：Ascenis RP-Amide柱(250mm×4.0mm ID，5.0μm)；DAD檢測器；檢測波長為254nm；流動相為磷酸二氫鉀溶液，pH4.0；流速為1.0 mL·min-1。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞核的提取

采用倒置熒光顯微鏡觀察到的細(xì)胞核提取結(jié)果如圖1所示，放大倍數(shù)20倍，象素441×358；圖1a顯示的是經(jīng)吉姆薩染液染色后的原位MCF-7細(xì)胞，由圖中可見細(xì)胞核和線粒體被染成藍(lán)色，細(xì)胞核和線粒體清晰可辨；圖1b則為經(jīng)吉姆薩染液染色后的純凈細(xì)胞核。對比圖1a和圖1b可知，我們所得到的細(xì)胞核已經(jīng)很純凈，表明提取成功，所得到的樣品可以用于下一步的電化學(xué)檢測和HPLC檢測。為保證細(xì)胞核的提取效率和測試結(jié)果可靠性，須保證測試所用細(xì)胞核現(xiàn)用現(xiàn)提，提取過程保持全程0～4℃。另外，研磨過程中細(xì)胞的破碎程度，直接影響到細(xì)胞核的提取效率，本文經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)勻漿研磨30次最為適宜；少量多次也可以提高提取效率。

圖1經(jīng)吉姆薩染液染色后的MCF-7細(xì)胞和細(xì)胞核

(a. 原位染色的細(xì)胞核；b. 提純后的細(xì)胞核)

2.2MCF-7細(xì)胞核在MWCNTs-IL/GCE上的電化學(xué)行為

MCF-7細(xì)胞裂解液和細(xì)胞核在MWCNTs-IL/GCE電極上的電化學(xué)行為如圖2所示，MCF-7細(xì)胞裂解液和細(xì)胞核在MWCNTs-IL/GCE上都呈現(xiàn)出良好的峰形，根據(jù)以前研究結(jié)果可知在+0.623 V處的信號歸因于鳥嘌呤與黃嘌呤的氧化，而+0.953 V處的信號歸因于腺嘌呤與次黃嘌呤的氧化[7]。加入蛋白酶K后的細(xì)胞核破碎溶液所得到的電化學(xué)響應(yīng)最強(qiáng)(圖2c)，而沒有加入蛋白酶K的細(xì)胞核的電化學(xué)響應(yīng)非常微弱(圖2a)，這表明盡管細(xì)胞核中含有較多嘌呤，但只有核破碎后才能得以釋放；故測試MCF-7細(xì)胞裂解液(圖2b)所得到的電化學(xué)響應(yīng)主要是細(xì)胞質(zhì)中嘌呤物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)。

圖2　MCF-7細(xì)胞和細(xì)胞核的單線掃描伏安圖

(a. 加入蛋白酶K前的純凈細(xì)胞核；b. MCF-7細(xì)胞裂解液；c. 加入蛋白酶K后的細(xì)胞核破碎溶液)

2.3高效液相檢測

MCF-7的細(xì)胞核裂解液與四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品(腺嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤，次黃嘌呤)的HPLC圖譜對照如圖3所示，MCF-7的細(xì)胞核裂解液的HPLC圖譜中得到了6個分離良好的色譜峰(圖3b)，其中四個色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)品圖中次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤的峰位一致(圖3a)，說明MCF-7細(xì)胞核中存在次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤，由此可以證明把電化學(xué)方法檢測的兩個信號歸因于四種嘌呤的氧化是正確的。

圖3　細(xì)胞核和四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

a. 嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品混合物；b. 細(xì)胞核裂解液A：腺嘌呤 G：鳥嘌呤 X：黃嘌呤 HX：次黃嘌呤

3討論

我們采用普利萊細(xì)胞核包漿制備試劑盒提取的MCF-7細(xì)胞核在MWCNTs-IL/GCE上可檢測出有兩個氧化峰，并且加入蛋白酶K破碎后信號得到明顯增強(qiáng)，這表明盡管細(xì)胞核中含有較多嘌呤，但只有核破碎后才能得以釋放；+0.623V處的信號歸因于鳥嘌呤與黃嘌呤的氧化，而+0.953V處的信號歸因于腺嘌呤與次黃嘌呤的氧化；HPLC結(jié)果證實電化學(xué)方法檢測的兩個信號歸因于四種嘌呤的氧化是正確的。此外，HPLC結(jié)果表明細(xì)胞核中除了四種嘌呤外，還含有其他的物質(zhì)，但具體是什么物質(zhì)還有待證實，我們將會在以后的研究中繼續(xù)探討。

參考文獻(xiàn):

[1]Byung-Cheon Lee, Jung Sun Yoo. Novel Threadlike structures (Bonghan Ducts) Inside Lymphatic Vessels of Rabbits Visualized With a Janus Green B Staining Method[J]. The Anatomical Record, 2005, 286B:1-7

[2]Yuan Wu，Lingyue Dong，Wei An，et al. Comparison between Different Methods to Extract Mitochondria and Its Effects on Mitochondria Content and Activity[J]. Journal of Capital Medical University, 2010, 4:31-32

[3]Fu Y,Yuan R,Tang D,et al.Study on the immobilization of anti-IgG on Au-colloid modified gold electrode via potentiometric immunosensor, cyclic voltammetry, and electrochemical impedance techniques[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2005, 40: 61-66

[4]Yohko Yamada, Koichi Makimura, Hossain Mirhendi,et al. Comparison of Different Methods for Extraction of Mitochondrial DNA form Human Pathogenic Yeasts[J]. Jpn J Infect Dis, 2002, 55: 122-125

[5]Liu Y,Qu X,Guo H,et al. Facile preparation of amperometric laccase biosensor with multifunctionbased on the matrix of carbon nanotubes-chitosan composite[J]. Biosensors and Bioelectronics,2006,21:2195-2201

[6]Volpe E,Cappelli G,Grassi M, et al. Gene expression profiling of human macrophages at late time of infection with Mycobacterium tuberculosis[J]. Immunology, 2006, 118:449-460

[7]Ji-Wen Cui,Tie-Jun Hou,Qian Wang,et al. An Enzyme Assisted Electrochemical Detection System of Purine Intracellular Utilizing MWCNTs-IL Modified Glassy Carbon Electrode[J]. Electrochimica Acta , 2015,180: 360-365

基金項目：①1.佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新課題，編號：LM2014-052；2.黑龍江省自然科學(xué)基金項目，編號：H201369。

作者簡介：王倩(1989～)女，山東濟(jì)寧人，在讀碩士研究生。 通訊作者:崔繼文(1967～)男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：cjwhljjms@jmsu.edu.cn。

中圖分類號：R965.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0147-02

(收稿日期：2016-01-16)