羅小華，王　影，潘曉華，畢艷旭，王淑靜，王　禹，韓小唯

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科，黑龍江 佳木斯 154003)

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左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織網(wǎng)格蛋白和dnmⅠ的表達(dá)影響①

羅小華，王影，潘曉華，畢艷旭，王淑靜，王禹，韓小唯

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通過氯化鋰—匹羅卡品(Li-pilo)致癇大鼠模型，探討左乙拉西坦對大鼠海馬組織網(wǎng)格蛋白和dnmⅠ的表達(dá)影響。方法：隨機(jī)將健康Wistar雄性4周齡大鼠96只，分為生理鹽水組，左乙拉西坦組，癲癇模型組，治療組，共4組，每組24只。用Li-pilo給大鼠造模，然后第1、2、4周斷頭取四組腦組織，用免疫組化檢測海馬組織網(wǎng)格蛋白和dnmⅠ的表達(dá)。結(jié)果：用Li-pilo組均出現(xiàn)癲癇發(fā)作。網(wǎng)格蛋白和dnmⅠ的表達(dá)量，左乙拉西坦組與生理鹽水組相比無差異，治療組、癲癇模型組與生理鹽水組相比表達(dá)量明顯增強(qiáng)，治療組與癲癇模型組相比表達(dá)量明顯減少。結(jié)論：用Li-pilo組網(wǎng)格蛋白和dnmⅠ的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，左乙拉西坦治療癲癇效果明顯，可能與它能減少癲癇大鼠海馬組織中網(wǎng)格蛋白和dnmⅠ的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：左乙拉西坦；癲癇；網(wǎng)格蛋白；dnmⅠ；大鼠海馬

癲癇是一種常見、反復(fù)因大腦神經(jīng)元突發(fā)異常放電而發(fā)作、病因復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥，具體發(fā)病機(jī)制還不明確，是一種慢性的短暫的大腦功能障礙疾病。兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育未成熟，易發(fā)生癲癇，據(jù)國內(nèi)多次大樣本調(diào)查，60%癲癇患者起源于小兒時(shí)期，長期發(fā)作會導(dǎo)致腦損傷甚至持久神經(jīng)精神障礙。經(jīng)常癲癇使大腦神經(jīng)元受損、突觸重建容易異位和突觸聯(lián)系容易中止，嚴(yán)重影響腦的正常發(fā)育[1]。左乙拉西坦(Levetiracetam,LEV)是毗咯烷類具有全新抗癲癇作用的新型藥物，治療各種癲癇效果好，其主要可能是與突觸囊泡蛋白2A結(jié)合發(fā)揮抗癲癇作用[2]。通過突觸區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，使神經(jīng)元間信號傳遞，其中突觸囊泡循環(huán)是神經(jīng)元遞質(zhì)傳遞核心。Dynamin-Ⅰ，又稱發(fā)動蛋白Ⅰ，即dnm1是一種突觸前膜蛋白，只在腦、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及神經(jīng)元突觸連接部位中特異性表達(dá)，主要參與囊泡從細(xì)胞膜到細(xì)胞漿的內(nèi)吞。dynamin-Ⅰ主要用處是接受各種調(diào)控后，聚集在囊泡頸部成環(huán)，此囊泡頸部被網(wǎng)格蛋白包裹內(nèi)陷，然后GTP水解調(diào)節(jié)收縮，使囊泡與突觸前膜分離，從而使胞吞過程完成[3]。網(wǎng)格蛋白是蛋白質(zhì)復(fù)合體，由一條重鏈蛋白和一條與重鏈蛋白緊密伴隨的輕鏈蛋白組成，對囊泡循環(huán)再生起關(guān)鍵作用。網(wǎng)格蛋白先招募后解離，分為[4]：開始招募銜接蛋白和網(wǎng)格蛋白；包被小凹內(nèi)陷縊裂及液泡芽殖；包被液泡脫殼三個過程。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組

將96只健康Wistar大鼠(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，隨機(jī)分四組： LEV組(左乙拉西坦組24只)，NS組(生理鹽水組24只)，Li-pilo組(癲癇模型組24只)，Li-pilo+ LEV組(左乙拉西坦治療組24只)，實(shí)驗(yàn)起始體重約為(200±20)g。

主要試劑：匹羅卡品和氯化鋰(美國西格瑪公司)、左乙拉西坦(比利時(shí)UCB.Pharma S.A.公司,批號：48167)、網(wǎng)格蛋白抗體和dnm1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、多聚甲醛(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

①根據(jù)文獻(xiàn)[5]建動物模型，測大鼠體重，治療組、癲癇模型組先腹腔注射氯化鋰125mg/kg，21h后給東莨菪堿1.6mg/kg，30min后注射匹羅卡品80mg/kg。觀察大鼠行為，凡連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅲ～Ⅴ級發(fā)作者造模成功，癲癇發(fā)作程度按Racine標(biāo)準(zhǔn)：0級：沒有抽搐；I級：面、耳抽動；Ⅱ級：節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級：前肢震顫；Ⅳ級：前肢伸值伴身體立起；Ⅴ級：跌倒和全身陣攣。造模成功一直抽搐30min后，立即注射地西泮10mg/kg，使發(fā)作停止。造模成功24h后，治療組和左乙拉西坦組每天灌胃左乙拉西坦200mg/kg，生理鹽水組及癲癇模型組每天灌胃等劑量生理鹽水，連續(xù)4周動態(tài)觀察，并分別于第1、2、4周取四組海馬組織(用多聚甲醛保存)用于實(shí)驗(yàn)。

②用免疫組化檢測網(wǎng)格蛋白和dnm1的表達(dá)水平 分別于li-pilo或生理鹽水注射前，注射后1W、2W、4W對著大鼠，用多聚甲醛給左心灌注，接著取海馬組織，然后放入4%多聚甲醛，使其固定海馬組織30min以上，最后用4℃冰箱保存?zhèn)溆谩：ｑR組織固定48h后切成2mm厚組織塊；進(jìn)行梯度乙醇脫水；二甲苯透明:二甲苯Ⅰ25min、二甲苯Ⅱ20min；浸蠟:石蠟Ⅰ熔點(diǎn) 52～54℃/40min、石蠟 II熔點(diǎn) 56～58℃/1h；包埋：石蠟Ⅲ熔點(diǎn) 60～61℃，包埋后輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切厚4μm片，56℃/4h烘干作為備用。進(jìn)行免疫組化，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒時(shí)，把顯色反應(yīng)停止，再次用酒精脫水和二甲苯透明，最后樹膠封片、鏡下觀察、照相[6]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表示，組間差異比較用方差分析，兩兩比較用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動物行為觀察

大鼠癲癇樣的發(fā)作在打針pilo大約15min后，行為：點(diǎn)頭，前肢陣攣抽搐，前肢伸直伴有身體立起，跌倒甚至全身驚厥。發(fā)作持續(xù)抽搐30min后立即注射地西泮終止抽搐。最后左乙拉西坦每天灌胃，結(jié)果治療組大鼠癲癇發(fā)作漸漸減少。

2.2LEV對網(wǎng)格蛋白和dnm1的表達(dá)量

網(wǎng)格蛋白和dnm1的免疫反應(yīng)產(chǎn)物重點(diǎn)集中在海馬區(qū)，各時(shí)間段生理鹽水組和左乙拉西坦組dnm1和網(wǎng)格蛋白OD比較，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各時(shí)間段癲癇模型組dnm1和網(wǎng)格蛋白OD與生理鹽水組比較，結(jié)果增高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各時(shí)間段治療組dnm1和網(wǎng)格蛋白OD與癲癇模型組比較，結(jié)果降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1～2。

表1　各組大鼠網(wǎng)格蛋白OD比較

注:a與NS組比較P<0.05；b與LEV組比較P<0.05；c與Li-pilo組比較P<0.05。

表2　各組大鼠dnm1OD比較

注:a與NS組比較P<0.05；b與LEV組比較P<0.05；c與Li-pilo組比較P<0.05。

3討論

癲癇是比較嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其是難治性癲癇的反復(fù)發(fā)作給患兒本身帶來了極大的痛苦，長時(shí)間的看護(hù)與治療也給患兒的家庭帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。癲癇發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要通過加強(qiáng)突觸囊泡循環(huán)使神經(jīng)元高度同步化激活，導(dǎo)致腦神經(jīng)元過度異常放電[7]。突觸囊泡循環(huán)是神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的基礎(chǔ)，癲癇患者神經(jīng)元突觸出問題，它功能明顯異常，通過加強(qiáng)突觸囊泡循環(huán)，使突觸傳遞的神經(jīng)沖動大大增加，從正常情況下數(shù)次或數(shù)十次每秒立即增加至數(shù)十次到數(shù)百次每秒，導(dǎo)致癇性放電到處傳播和散開[8]。網(wǎng)格蛋白和dnm1是囊泡循環(huán)中兩大重要蛋白。突觸囊泡循環(huán)主要包括胞吐、胞吞以及囊泡在細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)三個過程，其中，囊泡膜內(nèi)吞回收主要方式是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞，其在囊泡循環(huán)再生中起關(guān)鍵作用，并且在囊泡的內(nèi)吞過程中，需要依賴Dnm1從胞膜上剪切囊泡。Dnm1參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程，把每個囊泡回收到突觸前終末，使囊泡里面的神經(jīng)遞質(zhì)準(zhǔn)備下一次釋放，是囊泡再攝取過程中囊泡的必需成分。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，癲癇發(fā)作時(shí)Dnm1水平均顯著增強(qiáng)[9]，Dnm1的過度表達(dá)可能是維持這種異常同步放電的物質(zhì)基礎(chǔ)。內(nèi)吞包括網(wǎng)格蛋白依賴及非網(wǎng)格蛋白依賴兩種方式，癲癇突觸囊泡循環(huán)再生主要通過網(wǎng)格蛋白依賴內(nèi)吞，研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作時(shí)網(wǎng)格蛋白表達(dá)增強(qiáng)[10]，結(jié)果囊泡回收加強(qiáng)，通過突觸擴(kuò)布，形成異常高頻的癇樣放電，最終導(dǎo)致癲癇臨床發(fā)作。

本文通過實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果并發(fā)現(xiàn)隨著癲癇發(fā)作時(shí)間延長網(wǎng)格蛋白和Dnm1表達(dá)增強(qiáng)越明顯。左乙拉西坦是一種抗癲癇新型藥物，安全性高，不良反應(yīng)少，幾乎不影響肝腎功能及血液系統(tǒng)，可能與突觸囊泡蛋白2A結(jié)合，使神經(jīng)遞質(zhì)的釋放受影響，從而抗癲癇。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠中網(wǎng)格蛋白和Dnm1表達(dá)增強(qiáng)，使突觸囊泡循環(huán)再生加強(qiáng)，促進(jìn)囊泡回收，加重癲癇。LEV能很好控制癲癇發(fā)作，作用機(jī)制之一可能是通過下調(diào)海馬區(qū)網(wǎng)格蛋白和Dnm1表達(dá)發(fā)揮其抗癲癇作用。但癲癇發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，是多因素導(dǎo)致結(jié)果，海馬區(qū)網(wǎng)格蛋白和Dnm1表達(dá)的下調(diào)是否是LEV控制癲癇發(fā)作的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1]馮宏達(dá),王禹,王海燕,等.左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中突出后致密物PSD-95表達(dá)的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(04):63-64

[2]毛詩賢,馮亞梅,楚蘭,等.杏仁核點(diǎn)燃癲癇大鼠模型海馬組織突觸囊泡蛋白2A的表達(dá)變化[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2012,11:1008-1011

[3]Doherty G J, M cM ahonHT. M echan ism s of endocy tos is An-nu R ev Biochem, 2009,78:857-902

[4]姚鵬程,葉恭銀. 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用機(jī)制[J]. 生命科學(xué)研究,2003,S1:22-25+69

[5]Lynch BA,Lambeng N，Nocka K，et al.The synaptic vesicle protein SV2A is thebinding site for the antiepileptic drug levetiracetam[J].ProcNatlAcad SciU SA，2004，101(26)：9861-9866

[6]裴艷瑩,鄒艷紅,王海燕,等. 左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中CAMKⅡ及NCX3表達(dá)的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2015,38(04):31-34

[7]Aarts MM，Tymianski M.Molecular Mechanisms Underlying Specificity of Excitotoxic Signaling in Neurons[J].Curr Mol Med，2004，4(2)：137-147

[8]Schmid E M，Mcmahon H T.Integrating molecular and network biology to decode endocytosis[J].Nature,2007,448(7156):883-888

[9]肖爭. 癲癇突觸機(jī)制中發(fā)動蛋白、突觸融合蛋白、突觸囊泡膜蛋白及相關(guān)蛋白研究[D].重慶醫(yī)科大學(xué),2010

[10]龔云,王學(xué)峰,汪建華,等. 難治性癲癎患者腦組織突觸囊泡回收相關(guān)蛋白的表達(dá)[J]. 中華神經(jīng)科雜志,2006,03:155-158

基金項(xiàng)目：①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號：LM2015_016。

作者簡介：羅小華(1986～)男，湖南邵陽人，在讀碩士研究生。 通訊作者：王海燕(1957～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：276137680@qq.com。

中圖分類號：R749.1+7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0095-02

(收稿日期：2016-01-08)