王　禹，王海燕，王　婧，趙冬梅，趙塔娜，聶　磊，馮宏達(dá)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科，黑龍江 佳木斯 154003)

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左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中Syt1和PSD95表達(dá)的影響①

王禹，王海燕，王婧，趙冬梅，趙塔娜，聶磊，馮宏達(dá)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討抗癲癇藥物左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中的突觸囊泡膜蛋白Ⅰ(synaptotagminⅠ,Syt1)和突觸后致密物(PSD95)表達(dá)的影響。方法: 隨機(jī)將清結(jié)級(jí)Wistar雄性4周齡幼鼠84只,分為A、B、C組。A組：生理鹽水對(duì)照組 ，B組：模型組(Li-pilo組)，C組：治療組(LEV治療組) ，其中A組24只，B、C兩組組每組各30只。分組后分別給予造模，造模成功后，給予C組以LEV150mg/kg灌胃給藥每日一次，連續(xù)4周。采用免疫組化方法分別在1周、2周和4周動(dòng)態(tài)檢測3組大鼠海馬組織中Syt1和PSD95的表達(dá)。結(jié)果：B、C 兩組均出現(xiàn)癲癇樣發(fā)作。左乙拉西坦對(duì)照組組與生理鹽水對(duì)照組相比，Syt1和PSD95 各表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組的Syt1 的表達(dá)量明顯升高，PSD95的表達(dá)明顯減少，與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比，Syt1的表達(dá)量明顯降低而PSD95的表達(dá)有所增加，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:癲癇反復(fù)發(fā)作后可能誘導(dǎo) Syt1表達(dá)增強(qiáng)，Syt1可能通過增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放進(jìn)一步促進(jìn)癲癇發(fā)生。癲癇大鼠海馬組織中PSD95的表達(dá)水平明顯下降，左乙拉西坦能增強(qiáng)癲癇大鼠海馬組織中PSD95的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：左乙拉西坦；癲癇 ； 突觸囊泡膜蛋白Ⅰ；突出后致密物；大鼠海馬

神經(jīng)元間信號(hào)傳遞主要是通過突觸間的相互傳遞。突觸間的傳遞異常可造成腦細(xì)胞群出現(xiàn)異常的放電，即可引起癲癇發(fā)作，可產(chǎn)生突然的、短暫的腦功能障礙。由于兒童與成人不同，腦組織等尚未發(fā)育健全，故較成人更易發(fā)生癲癇。而反復(fù)發(fā)作的癲癇更可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[1]。Syt1又叫突觸結(jié)合蛋白-1，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸囊泡特有的膜的內(nèi)在蛋白質(zhì), 其位置位于突觸前膜。是最主要的Ca2+感受器之一，在調(diào)節(jié)突觸傳遞方面起到重要作用。有實(shí)驗(yàn)表明[2]，在癲癇大鼠海馬組織中Syt-1可以通過調(diào)節(jié)谷氨酸(Glu)等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放進(jìn)一步影響神經(jīng)突觸可塑性,從而引發(fā)癲癇發(fā)生。PSD95是一種位于突觸后膜的蛋白-蛋白復(fù)合體，它能整合信號(hào)分子、調(diào)節(jié)分子和靶分子在突觸后膜[3]，促進(jìn)突觸可塑性,而突觸可塑性和結(jié)構(gòu)的改變是異常放電反復(fù)發(fā)生的的基本原因[4]。左乙拉西坦(levetiracetam, LEV)是一種新型廣譜抗癲癇藥物，已有研究表明其與突觸囊泡有關(guān)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

選用84只清潔級(jí)的Wistar大鼠(佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，體重均在(90±10)g，隨機(jī)分為3組，用記號(hào)筆標(biāo)注。A組：生理鹽水對(duì)照組 ，B組：模型組(Li-pilo組)，C組：治療組(LEV治療組) ，其中A組24只，B、C兩組組每組各30只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

主要試劑有: 氯化鋰 (上海寶泰生物科技公司)、匹羅卡品(德國Sig公司)、左乙拉西坦片(UCB Pharma 比利時(shí))、兔抗大鼠Syt1抗體(上海寶泰生物科技有限公司)、兔抗大鼠PSD95抗體(上海寶泰生物科技有限公司)。

1.3動(dòng)物模型的制備

參照相關(guān)文獻(xiàn)[5]建立動(dòng)物模型，給予B、C兩組按氯化鋰腹腔注射按100mg/kg計(jì)算，再于20h后，給予東莨菪堿腹腔注射按l.0mg/kg計(jì)算，再于30min后給予腹腔注射匹羅卡品按80mg/kg計(jì)算，同時(shí)觀察大鼠癲癇發(fā)作情況。參照癲癇發(fā)作RACINE等級(jí)分級(jí)。0級(jí):大鼠表現(xiàn)無反應(yīng)或抽搐停止;1級(jí):大鼠的嘴和面部出現(xiàn)節(jié)律性抽動(dòng);2級(jí):大鼠可出現(xiàn)點(diǎn)頭或甩尾;3級(jí):大鼠單側(cè)肢體抽動(dòng);4級(jí):大鼠多肢抽動(dòng)或強(qiáng)直;5級(jí):全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作甚至不自主跌倒。選擇出現(xiàn)4級(jí)或以上發(fā)作的大鼠，且發(fā)作持續(xù)30min后再給予地西泮10mg/kg腹腔注射終止發(fā)作。選擇各組符合條件的鼠每組各24只，C組在成功造模24h后給予左乙拉西坦200mg/kg灌胃，其他兩組則給予相同劑量的生理鹽水灌胃，均為每日一次，連續(xù)4周，動(dòng)態(tài)觀察，并分別于第1周、2周、4周提取海馬組織于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4應(yīng)用免疫組化方法檢測大鼠海馬組織中Syt1和PSD-95的表達(dá)水平

先將甲醛溶液中的海馬組織取出并置20%蔗糖溶液(4℃)中24h。將海馬組織取出并通過石蠟包埋切片進(jìn)行免疫組化染色。

按照說明進(jìn)行免疫組化染色，按照脫蠟水化—抗原修復(fù)—血清封閉—滴加一抗—滴加二抗—復(fù)染—脫水后充分晾干后中性樹膠封片的步驟逐一操作。 在顯微鏡鏡下(X400)觀察每張切片免疫組化

染色后海馬陽性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1觀察動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)

在腹腔注射匹羅卡品約10min后B組和C組大鼠均出現(xiàn)0～5級(jí)等不同程度的癲癇發(fā)作，甚至全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。給予止抽后再給予LEV200mg/kg每日一次灌胃，發(fā)現(xiàn)C組與B組大鼠比較，癲癇發(fā)作的程度及次數(shù)均明顯減少。

2.2Syt1免疫組化結(jié)果

免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要分布在海馬區(qū)，呈棕黃色圓形或橢圓形。與A組比較，B組大鼠海馬中的Syt1免疫反應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，PSD-95免疫反應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與B組比較，各時(shí)間點(diǎn)C組海馬組織中Syt1表達(dá)減少(P<0.05)而PSD-95表達(dá)減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1～2。

表1　各組大鼠海馬組織中Syt1陽性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=8)

注：ΔLEV組與NS組比較：P>0.05；*Li-PILO與NS組比較：P<0.05；※LEV治療組與Li-PILO組比較：P<0.05。

表2　各組大鼠海馬組織中PSD-95陽性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=8)

注：ΔLEV對(duì)照組與NS組比較：P>0.05；*Li-PILO與NS組比較：P<0.05；※LEV治療組與Li-PILO組比較：P<0.05。

3討論

癲癇是由于突觸間的傳遞異?？稍斐赡X細(xì)胞群出現(xiàn)異常的放電[6]。兒童處于生長發(fā)育期，神經(jīng)系統(tǒng)尚未發(fā)育健全，長期反復(fù)的癲癇發(fā)作可嚴(yán)重影響其日后生長發(fā)育及生活質(zhì)量。癲癇可造成神經(jīng)元損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織損傷甚至是永久性的損害。區(qū)別于傳統(tǒng)抗癲癇藥物，新一代左乙拉西坦(LEV)，是通過多種機(jī)制發(fā)揮作用。研究表明[7]，在匹羅卡品誘發(fā)的癲癇大鼠中，LEV能明顯減少海馬神經(jīng)細(xì)胞的死亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)神經(jīng)元突觸重建有著重要的影響。通過本次實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，模型組中大鼠海馬組織中Syt1的細(xì)胞數(shù)表達(dá)明顯高于鹽水對(duì)照組，而經(jīng)LEV治療組中海馬組織中Syt1的表達(dá)水平與模型組比較明顯降低。由此可推測，LEV可以通過控制癲癇發(fā)作，減少突出囊泡的循環(huán)，減輕突觸損害的程度，進(jìn)而抑制癲癇大鼠海馬組織中Syt1的表達(dá)和減輕PSD-95的降低程度，在影響突觸囊泡、Ca2+和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)等在異常突觸間的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮其抗癲癇作用。

參考文獻(xiàn):

[1]王海燕，王影，聶磊，等.左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013,36(3):6-8

[2]Burkhardt C, Muller M, Badde A, et al. Semaphorin 4B interacts with thepost-synaptic density protein PSD-95/SAP90 and is recruited to synapses through C-terminal PDZ-binding motif[J]. FEBS-Lett, 2005, 579(17): 3821-3828

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基金項(xiàng)目：①黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題，編號(hào)：2014-225。

作者簡介：王禹(1968～)男,黑龍江佳木斯人,學(xué)士，副主任醫(yī)師。

中圖分類號(hào):R742.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)04-0014-02

(收稿日期：2016-01-21)