王　霖　王　輝　李才信　瞿春燕　馬元肖

熒光定量PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用研究

王霖王輝李才信瞿春燕馬元肖

【摘要】目的探討熒光定量PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法采用濃縮集菌涂片抗酸染色顯微鏡檢查、美國BD960型分枝桿菌培養(yǎng)儀進(jìn)行結(jié)核菌快速培養(yǎng)鑒定、熒光定量PCR結(jié)核分枝桿菌檢測三種方法同時(shí)檢測1000例肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本，比較檢測結(jié)果。結(jié)果PCR技術(shù)診斷陽性276例，陽性率27.6%（276/1000）；結(jié)核菌快速培養(yǎng)陽性252例，陽性率25.2%（252/1000）；涂片抗酸染色顯微鏡檢查172例，陽性率17.2%（172/1000），結(jié)核抗酸菌涂片陽性率低于PCR技術(shù)及快速培養(yǎng)法（P＜0.05），且熒光定量PCR技術(shù)與結(jié)核菌診斷金標(biāo)準(zhǔn)快速培養(yǎng)陽性符合率為91.3%（252/276）。結(jié)論熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌DNA技術(shù)，對結(jié)核病進(jìn)行診斷，與傳統(tǒng)的涂片、培養(yǎng)相比較，可提高肺結(jié)核診斷的敏感性、特異性和及時(shí)性，以期使肺結(jié)核患者得到早期診斷及有效治療。

【關(guān)鍵詞】熒光定量；PCR技術(shù)；肺結(jié)核；診斷；應(yīng)用

Objective To investigate the value of real-time PCR technique in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.Methods Tuberculosis acid-fast smear examination，culture and identification of TB rapid，quantitative PCR three methods simultaneously detect 1000 cases of tuberculosis patients sputum samples，comparing the detected results.Results PCR diagnostic technique positive 276 cases，the positive rate of 27.6%（276/1000）.Rapid TB culture positive 252 cases，the positive rate of 25.2%（252/1000）.Tuberculosis acid-fast smear examination 172 cases，the positive rate of 17.2%（172/1000），acid-fast bacilli smear-positive tuberculosis rate was much lower than PCR technique and rapid culture（P＜0.05），and quantitative PCR and rapid TB diagnostic gold standard culture positive rate was 91.3%（252/276）.Conclusion The fluorescence quantitative PCR detection of tuberculosis DNA technology can improve TB diagnostic sensitivity，specificity and timeliness，so that TB patients receive early diagnosis and effective treatment.

【Key words】Fluorescence quantitative，PCR technology，Tuberculosis，Diagnosis，Application

結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸確認(rèn)的重要依據(jù)。提高實(shí)驗(yàn)室檢測能力，促進(jìn)早診斷、早治療是有效控制結(jié)核病蔓延的必要措施。目前臨床以集菌培養(yǎng)和涂片鏡檢法為主要的實(shí)驗(yàn)室檢測手段［1］。大量研究表明傳統(tǒng)方法的培養(yǎng)周期長、檢出率低，難以滿足臨床需要。熒光定量PCR技術(shù)通過用一對結(jié)核分枝桿菌特異性引物和一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴(kuò)增法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，是一種重要的基因診斷技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好、可定量、污染少，易于標(biāo)準(zhǔn)化、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)［2］。本研究建立熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的方法，并對熒光定量PCR技術(shù)在臨床肺結(jié)核診斷和療效評估中的應(yīng)用進(jìn)行評價(jià)，以期使肺結(jié)核患者得到早期診斷及有效治療，為醫(yī)院增加經(jīng)濟(jì)效益，讓患者和公眾受益，產(chǎn)生較好的社會(huì)效益和生態(tài)效益。

1　資料與方法

1.1樣本來源

收集2015年9月～2016年3月昆明市傳染病醫(yī)院的1000例疑似肺結(jié)核患者，年齡18～60歲，男635例，女365例。采集所有患者痰標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2方法

1.2.1儀器美國伯樂B?O-RADCFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測儀，奧林巴斯顯微鏡，美國BDBACTECMG?T 960分枝桿菌/培養(yǎng)、鑒定、藥敏快速自動(dòng)檢測系統(tǒng)。

1.2.2標(biāo)本處理痰液中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30 min左右液化，取1 ml～1.5 ml離心管中，12000 rpm離心5 min。去上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml打勻，12000 rpm離心5 min；再重復(fù)洗滌2次。沉淀直接加50μlDNA提取液充分混勻，提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時(shí)需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截）。金屬浴10 min（誤差不超過1 min）。12000 rpm離心5 min。

1.2.3檢測方法所有標(biāo)本均采用濃縮集菌涂片抗酸染色顯微鏡檢查、結(jié)核菌快速培養(yǎng)鑒定、熒光定量PCR結(jié)核分枝桿菌檢測三種方法同時(shí)檢測。

結(jié)核涂片抗酸檢查：按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》要求常規(guī)操作［3］。

結(jié)核菌快速培養(yǎng)鑒定：痰標(biāo)本經(jīng)4%NaOH消化處理后接種培養(yǎng)瓶放入美國BD960型分枝桿菌培養(yǎng)儀進(jìn)行結(jié)核菌快速培養(yǎng)鑒定；噻吩-2-羧酸肼（PNB）生長試驗(yàn)進(jìn)行分枝桿菌菌型鑒定，具體參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》常規(guī)操作［4］。

熒光定量PCR測定：取單管單人份PCR反應(yīng)管若干，直接加入處理后樣品或陰性物質(zhì)2μl，8000 rpm離心數(shù)秒。將各反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：93℃→2 min預(yù)變性，然后按93℃45 s→55℃120 s，共做30個(gè)循環(huán)后置33℃保溫。PCR反應(yīng)后熒光監(jiān)測，待各PCR管充分冷卻至33℃，迅速逐個(gè)將擴(kuò)增后的反應(yīng)管放入熒光檢測儀，讀取并記錄讀書A1。熒光激發(fā)波長為487 nm，檢測波長為525 nm。

質(zhì)量控制：陰性質(zhì)控品：增長的曲線不呈S型或Ct值為空白。陽性質(zhì)控品：增長曲線呈S型，且強(qiáng)陽性質(zhì)控品定量參考值在1×106基因拷貝/ml～2×107基因拷貝/ml，臨界陽性質(zhì)控品定量參考值在2×102基因拷貝/ml～2×104基因拷貝/ml。

結(jié)果解釋：陰性結(jié)果判定：如果定量值＜5.000E+02，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。陽性結(jié)果判定：如果定量值＞5.000E+02，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0軟件，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用卡方校驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1熒光定量PCR技術(shù)與結(jié)核菌快速培養(yǎng)檢測結(jié)果比較

PCR技術(shù)診斷陽性276例，陽性率27.6%；結(jié)核菌快速培養(yǎng)陽性252例，陽性率25.2%，PCR技術(shù)診斷陽性率高于結(jié)核菌快速培養(yǎng)，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.675，P＜0.05），且PCR技術(shù)與快速培養(yǎng)陽性符合率為91.3%（252/276），見表1。

2.2熒光定量PCR技術(shù)與結(jié)核涂片抗酸檢查結(jié)果比較

PCR技術(shù)診斷陽性276例，陽性率27.6%；結(jié)核涂片抗酸檢查172例，陽性率17.2%。結(jié)核抗酸菌涂片陽性率低于PCR技術(shù)診斷陽性率，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.517，P＜0.05），且PCR技術(shù)與結(jié)核抗酸菌直接涂片法陽性符合率為62.3%（172/276），見表2。

表1　熒光定量PCR技術(shù)與結(jié)核菌快速培養(yǎng)檢測結(jié)果

表2　熒光定量PCR技術(shù)與結(jié)核涂片抗酸檢查結(jié)果

3　討論

肺結(jié)核病原學(xué)檢測是發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌的重要途徑。傳統(tǒng)直接涂片抗酸染色顯微鏡檢查雖然在操作性、及時(shí)性及經(jīng)濟(jì)性方面具有一定優(yōu)勢，但是敏感性較低，通常標(biāo)本需達(dá)到100000條菌/ml的濃度才得到陽性結(jié)果，特異性差［5-7］。而培養(yǎng)法作為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有較高的敏感度和特異性，但該方法具有周期長的缺點(diǎn)，常常需要4～8周才能出結(jié)果，且在結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的辨別上，需要采用進(jìn)一步鑒定［8-9］。

熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對熒光信號累積的監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)對PCR進(jìn)程的監(jiān)測，并能通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)缺陷對樣品中的DNA或cDNA進(jìn)行測定，1 d即可發(fā)放檢驗(yàn)結(jié)果。該方法，在密閉狀態(tài)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有效保證了擴(kuò)增物的無污染性，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測的靈敏度與特異性也較高［10-12］。

本研究中收集1000例肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本，經(jīng)過三種方法檢測，結(jié)果顯示，熒光定量PCR技術(shù)診斷陽性率27.6%，結(jié)核菌快速培養(yǎng)陽性率25.2%，結(jié)核涂片抗酸檢查陽性率17.2%。結(jié)核抗酸菌涂片陽性率低于熒光定量PCR技術(shù)及快速培養(yǎng)法（P＜0.05）。熒光定量PCR技術(shù)與快速培養(yǎng)陽性符合率為91.3%，原因是結(jié)核患者用抗結(jié)核藥物治療后，結(jié)核菌受到抑制，無法培養(yǎng)出活的結(jié)核菌，但PCR技術(shù)可以檢測出結(jié)核菌的基因片段，說明結(jié)核菌PCR技術(shù)診斷肺結(jié)核的特異性及敏感性均較高。此外，本實(shí)驗(yàn)室潔凈度達(dá)到BSL-3生物安全實(shí)驗(yàn)室及環(huán)保相關(guān)要求，通過及早診斷、及早治療，有效控制結(jié)核病，為營造和諧、健康的環(huán)境起到積極作用。

綜上所述，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，診斷肺結(jié)核由傳統(tǒng)培養(yǎng)法的4～8周縮短至1 d即可發(fā)放檢驗(yàn)結(jié)果，能使肺結(jié)核患者得到早期診斷及有效治療，縮短患者診斷時(shí)間，降低患者治療費(fèi)用，對有效控制結(jié)核病起到積極的作用。

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【中圖分類號】R440

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）11-0169-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.11.115

作者單位：昆明市傳染病醫(yī)院/昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明650301

Application of Fluorescence Quantitative PCR Technique in the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis

WANG Lin WANG Hui LI Caixin QU Chunyan MA Yuanxiao Department of Laboratory，Kunming Municipal Infectious Disease Hospital/ Kunming Third People's Hospital，Kunming Yunnan 650301，China

【Abstract】