吳琨鵬 易健 彭千元 湯艷 周勝強(qiáng) 劉柏炎

摘要：目的 觀察六味地黃湯對快速衰老小鼠認(rèn)知功能及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）/Notch信號通路表達(dá)的影響，探討其改善認(rèn)識障礙的作用機(jī)制。方法 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組和六味地黃湯高、中、低劑量組，頸部皮下注射D-半乳糖制作快速衰老小鼠模型，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。Morris水迷宮系統(tǒng)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化檢測小鼠腦組織bFGF、Notch1、Hes1的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠潛伏期延長、跨臺次數(shù)減少（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠潛伏期縮短、跨臺次數(shù)增多（P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組效果明顯（P<0.01）；各給藥組小鼠bFGF、Notch1、Hes1陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較模型組升高（P<0.05，P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組升高明顯（P<0.01）。結(jié)論 六味地黃湯可能通過增加bFGF的表達(dá)，激活Notch信號通路，達(dá)到改善衰老小鼠認(rèn)知功能障礙。

關(guān)鍵詞：六味地黃湯；認(rèn)知功能；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；Notch1；Hes1；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.019

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0074-03

衰老是很多慢性疾病的基礎(chǔ)，其中老年認(rèn)知功能障礙發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響老年人群的生活質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦為髓海，靈機(jī)記性在腦，腎生髓，通于腦，腎與腦的關(guān)系密切，因而改善認(rèn)知障礙的藥物多具有補(bǔ)腎功效[1]。六味地黃湯為滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典方劑，三補(bǔ)三瀉，以補(bǔ)為主，補(bǔ)而不膩，研究顯示，六味地黃湯具有健腦益智的作用[2-3]，但具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立快速衰老認(rèn)知功能障礙模型，觀察六味地黃湯對衰老小鼠認(rèn)知功能及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）/Notch信號通路表達(dá)的影響，探討其改善認(rèn)知障礙的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

昆明種成年小白鼠40只，雄性，健康清潔級，體質(zhì)量（20±2）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號SCXK（湘）2011-0003。室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水飲食。

1.2 藥物及制備

六味地黃湯（熟地黃24 g，山藥12 g，澤瀉9 g，山萸肉12 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)杏林藥房。傳統(tǒng)方法煎煮，六味地黃湯濃縮至4 g原藥材/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞S生素E注射液，江西博萊大藥廠，批號20140404。

1.3 主要試劑與儀器

D-半乳糖、SP-9000和bFGF、Notch1、Hes1免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司。TP-1000電子天平（湘儀天平儀器廠），水迷宮動物行為學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)（法國Viewpoint），BX-51光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼攝影數(shù)字彩超圖像分析儀系統(tǒng)（日本Olympus）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，小鼠死亡4只。余36只隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組和六味地黃湯高、中、低劑量組，每組6只。除正常組外，其余各組小鼠頸部皮下注射D-半乳糖0.5 g/（kg·d），正常組小鼠予生理鹽水等體積皮下注射，連續(xù)8周，復(fù)制快速衰老小鼠模型。60 kg體質(zhì)量人體表面積臨床等效劑量為小鼠六味地黃湯中劑量組給藥量，高、中、低劑量組灌胃量分別為2、1、0.5 g/（kg·d），正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，陽性對照組給予維生素E注射液灌胃。灌胃體積均為10 mL/（kg·d），連續(xù)8周。治療前后均采用Morris水迷宮系統(tǒng)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。第8周行水迷宮實(shí)驗(yàn)后所有小鼠斷頸處死，取腦組織，免疫組化檢測小鼠腦組織bFGF、Notch1、Hes1的表達(dá)。

2.2 行為學(xué)測試

2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 每日固定時間段，每個時間段訓(xùn)練4次，連續(xù)5 d。第1次將小鼠遠(yuǎn)離目標(biāo)象限面向池壁放入池中，記錄小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），后3次將小鼠分別從其余3個不同象限放入水中，歷時120 s。120 s內(nèi)找不到平臺者潛伏期記錄為120 s，每次訓(xùn)練間隔20 s。取其平均值作為小鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績。

2.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 第6日撤除平臺，將小鼠從任意一區(qū)入水，記錄小鼠120 s內(nèi)跨越原平臺次數(shù)。

2.3 免疫組化檢測小鼠腦組織堿性成纖維細(xì)胞生長因子、Notch1、Hes1的表達(dá)

將保存的腦組織取出，梯度脫水，石蠟封片、切片、烤片，再按試劑盒說明進(jìn)行免疫組化檢測，最后行封片處理，400倍鏡下隨機(jī)選取6個不重復(fù)視野，圖像分析系統(tǒng)測算陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，符合正態(tài)性及方差齊性者采用方差分析，若方差不齊，則用Tamhane's T2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 六味地黃湯對模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠平均逃避潛伏期延長、跨臺次數(shù)減少（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠潛伏期縮短、跨臺次數(shù)增多（P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組效果明顯（P<0.01）。結(jié)果見表1。

地黃湯高劑量組比較，##P<0.01

4.2 六味地黃湯對模型小鼠腦組織堿性成纖維細(xì)胞生長因子、Notch1、Hes1表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠bFGF、Notch1、Hes1陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各給藥組小鼠bFGF、Notch1、Hes1陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較模型組升高（P<0.05，P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組效果明顯（P<0.01）。結(jié)果見表2。

5 討論

腦衰老所致認(rèn)知功能障礙屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變，成年哺乳動物內(nèi)仍存在神經(jīng)干細(xì)胞，正確選擇或開發(fā)出能促進(jìn)神經(jīng)元再生與重建的藥物，通過修復(fù)及替代受損神經(jīng)元，構(gòu)建新的神經(jīng)環(huán)路改善認(rèn)知功能，將會給老年認(rèn)知功能障礙患者帶來新的希望。干細(xì)胞與中醫(yī)學(xué)先天之精的來源、分布、功能高度相似[4]，腎為先天之本，蟄藏先天之精，而六味地黃湯為滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典方劑，其具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖、分化及益腦健智的作用[5]。

Notch信號通路是在進(jìn)化過程中一種高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育參與神經(jīng)發(fā)生過程，決定著中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞是選擇繼續(xù)增殖還是向神經(jīng)元分化。Notch1則通過Notch信號的改變調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的比例，Hes1則是Notch信號通路的關(guān)鍵靶基因，神經(jīng)元分化作用也依賴于Hes1，且Hes1亦可通過調(diào)節(jié)下游的Mash1來調(diào)控成體神經(jīng)細(xì)胞的生成，后者被認(rèn)為與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系[6-8]。Notch1及Hes1表達(dá)升高提示Notch通路激活干細(xì)胞進(jìn)入增殖階段，反之則為干細(xì)胞分化為功能細(xì)胞[9-11]。

bFGF是一種多肽分子，具有很強(qiáng)的促細(xì)胞生長作用很強(qiáng)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，激活不同區(qū)域的神經(jīng)元前體細(xì)胞潛在的再生能力。而于內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化中，能激活Notch通路，誘導(dǎo)Hes1的表達(dá)，使NSCs處于增殖狀態(tài)，為之后的神經(jīng)元遷移、分化做好準(zhǔn)備[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，六味地黃湯高劑量組能顯著增加bFGF、Notch1、Hes1的表達(dá)，改善快速衰老小鼠認(rèn)知能力。我們認(rèn)為增加bFGF的表達(dá)，激活Notch信號通路，可能為六味地黃湯改善衰老認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫理軍，王興.補(bǔ)腎中藥對腎虛質(zhì)大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2015，22（10）：64-66.

[2] 易健，劉柏炎，蔡光先.超微六味地黃湯對老年癡呆大鼠認(rèn)知功能和腦組織堿性成纖維生長因子表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011， 17（21）：139-142.

[3] 莊賀，王家鵬，莊慧魁.六味地黃湯加減聯(lián)合丁咯地爾對老年血管性癡呆認(rèn)知功能及日常生活能力的改善作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12（5）：588-589.

[4] 黃曉芹，羅再瓊.中醫(yī)“腎精”與現(xiàn)代干細(xì)胞研究的同一性探討[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，35（2）：5-6，9.

[5] 陳攀，徐志偉，敖海清，等.基于海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化機(jī)制探討肝腎“藏泄互用”關(guān)系的內(nèi)涵[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（5）：1202- 1206.

[6] 王飛，李世亭.Notch1基因在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報，2004，25（4）：283-285.

[7] 高慧麗，張廣宇，段冉冉，等.阿爾茨海默病小鼠模型中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化[J].中國病理生理雜志，2014，30（3）：467-472.

[8] 郇林春，趙旺淼，楊新宇.Hes1蛋白在神經(jīng)細(xì)胞生成中的作用[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2008，35（5）：438-441.

[9] 付海燕，杜紅陽，包翠芬.地黃多糖誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化及對Notch1和Jagged1蛋白表達(dá)的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2014， 39（6）：448-453.

[10] 白瑞櫻，盧娜.Hes1 mRNA在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中表達(dá)變化的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（33）：4048-4050.

[11] 陳娉婷，周小青，劉旺華，等.丹龍醒腦方對腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及Hes1、Hes5表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（1）：69-73.

[12] 高博，邢雪松.Hes1信號分子在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化中的作用[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，12（2）：122-124.