潘宜鵬，劉　煜，李　明，任秀昀

(1. 武警總醫(yī)院移植科，北京　100039；2. 武警總醫(yī)院醫(yī)務部，北京　100039；3. 武警總醫(yī)院超聲科，北京　100039)

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改良顱內(nèi)加壓法兔腦死亡模型建立及其狀態(tài)的維持

潘宜鵬1，劉煜1，李明2，任秀昀3

(1. 武警總醫(yī)院移植科，北京100039；2. 武警總醫(yī)院醫(yī)務部，北京100039；3. 武警總醫(yī)院超聲科，北京100039)

【摘要】目的探尋改良顱內(nèi)加壓法制作兔腦死亡模型及維持腦死亡狀態(tài)的方法。方法新西蘭大白兔15只，隨機分成2組：假手術(shù)組(B組，n=6)，僅顱內(nèi)插管，行麻醉維持；腦死亡組(A組，n=9)，通過改良的顱內(nèi)加壓法制作腦死亡模型。記錄平均動脈壓(MAP)和心率(HR)的變化。通過呼吸機和血管活性藥物將生命體征維持在某一可控水平。結(jié)果A組9只兔中8只建模成功，在顱內(nèi)加壓過程中隨著顱內(nèi)壓力的增高，MAP和HR呈波浪狀逐漸升高。麻醉狀態(tài)下和腦死亡時MAP峰值分別為(80.63±8.45) mmHg、(111.63±7.71) mmHg，二者相比有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。麻醉狀態(tài)下、腦死亡時和腦死亡后2 h的HR分別為(153.25±14.35) 次/min、(262.38±16.60) 次/min和(218.50±10.27) 次/min，三者之間兩兩相比具有統(tǒng)計學差異(P < 0.05)。結(jié)論與傳統(tǒng)術(shù)式相比，改良后的方法可以穩(wěn)定、可靠地建立兔腦死亡模型；通過及時有效的呼吸、循環(huán)支持，腦死亡狀態(tài)可以長時間維持。

【關(guān)鍵詞】腦死亡；模型制作；兔；生命體征

隨著我國器官捐獻工作的法制化，腦死亡器官捐獻(donor after brain death, DBD)和腦-心雙死亡標準器官捐獻(donation after brain death plus cardiac death, DBCD)為我國現(xiàn)階段的主要器官捐獻類型[1]。而DBD和DBCD患者都不可避免地經(jīng)歷低血壓、低氧血癥及長時間熱缺血損傷[2]，嚴重影響器官質(zhì)量[3]。因此建立一個穩(wěn)定的動物腦死亡模型及腦死亡狀態(tài)長時間維持對于研究腦死亡供者器官的變化至關(guān)重要。我研究所將傳統(tǒng)的制作過程進行改良，使其具有很好的可操作性，并可較長時間的維持腦死亡狀態(tài)，為腦死亡器官捐獻的臨床研究奠定了模型基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPS級新西蘭雄性兔15只，體重2.2～2.8 kg，12周齡。由中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供【SCXK(京)2011-0006】。實驗在中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院動物實驗中心進行【SYXK(軍)2012-0062】。

1.2實驗儀器與試劑

BL-420生物技能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、HX-100E動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)、JR. 1/2智能恒溫控制儀 (成都泰盟科技有限公司)、便攜超聲儀器(意大利百勝公司，型號：MyLab 30 Gold)、Foley氣囊導管(美國巴德國際有限公司)等。多巴胺注射液(2 mL∶20 mg，批號：33140506，上海禾豐制藥有限公司)。

1.3改良兔腦死亡模型的建立方法

術(shù)前準備：術(shù)前兔禁食12 h，自由飲水。稱重后進行誘導麻醉(枸櫞酸芬太尼注射液和咪達唑侖注射液混合制劑肌注)。耳緣靜脈滴注咪達唑侖注射液和鹽酸賽拉嗪注射液進行麻醉維持。備皮，沿頸部做一縱切口，游離氣管行氣管插管后固定，備接呼吸機，縫合皮膚。于右側(cè)腹股溝區(qū)做一斜行切口游離出股動脈及股靜脈。行股動脈插管，連接壓力傳感器；留置股靜脈插管，肝素封管以備術(shù)中采血，縫合皮膚。額、頂和枕極顱骨骨膜下埋置腦電圖銀針電極。四肢連接心電圖導聯(lián)。便攜超聲儀監(jiān)測心臟超聲，描記心率。自動溫度監(jiān)測儀監(jiān)測兔肛溫，通過加熱設備維持在37.5℃。

顱內(nèi)球囊導管植入方法：于顱頂正中做矢狀切口，分離皮下組織和骨膜至顱骨面，于雙眼角后緣連線中點后方0.5 cm旁開0.5 cm處，用木刻雕刀刻出直徑約0.5 cm大小孔道(兔顱骨厚度約2 mm，操作時勿傷及硬腦膜及腦組織)，保持硬腦膜完整，置入6號Foley 球囊導管。骨蠟封閉，縫合切口。保留6號Foley 球囊導尿管。腦死亡組經(jīng)導管漸進式注入生理鹽水，每次 0.5 mL，緩慢勻速，間隔約5分鐘，總?cè)肓考s2 mL時每次注入0.2 mL，兔出現(xiàn)躁動，瞳孔逐步縮小，球結(jié)膜水腫，自主呼吸停止后停止加壓。自主呼吸停止時，氣管插管接動物呼吸機，設置呼吸頻率 35 次/min，潮氣量 25 mL/kg，吸呼比 5∶4，氧濃度50%[4]。保留導管內(nèi)生理鹽水至實驗結(jié)束。腦死亡的確認參照衛(wèi)生部腦死亡判定標準起草小組制定的《腦死亡判定標準》及國外文獻，擬定本實驗腦死亡模型建立標準：①麻醉停止后仍處于深昏迷狀態(tài)；②瞳孔散大，對光反射消失，角膜反射消失；③自主呼吸停止，自主呼吸誘發(fā)實驗陰性；④腦電圖靜息成直線；⑤阿托品實驗陰性[4-5]。

腦死亡狀態(tài)維持方法：我們認為加壓過程中兔自主呼吸停止則腦死亡誘導成功，此后開始進行腦死亡狀態(tài)維持，觀察指標變化，多巴胺 4 μg/(kg·min)靜脈滴入維持血壓，并隨血壓變化調(diào)整輸液速度，本實驗維持腦死亡狀態(tài)8 h后撤除呼吸機，處死兔。手術(shù)全程輸注液體300 mL。假手術(shù)組僅行硬膜外插管，不加壓。余操作和腦死亡組相同。

1.4監(jiān)測指標

監(jiān)測所有實驗動物平均動脈壓、心率等變化。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

2結(jié)果

2.1兔腦死亡模型建立

腦死亡組有8只成功建立腦死亡模型，并且均維持超過8 h；其中1只實驗過程中出現(xiàn)心衰，經(jīng)搶救無效死亡；另外8只均采用緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型，球囊內(nèi)緩慢間斷注入生理鹽水(2.4±0.2) mL時，兔即出現(xiàn)腦死亡表現(xiàn)。兔體溫維持在(37±0.3)℃。尿量(0.52±0.16) mL/min。每只兔的總建模時間為(100±10) min，其中誘導腦死亡時間(30±5) min。8只兔均維持腦死亡狀態(tài)480 min以上。假手術(shù)組麻醉狀態(tài)下維持8 h后，撤除麻藥后半小時內(nèi)6只兔均自然蘇醒，然后空氣栓塞處死。實驗結(jié)束后焚燒兔。

2.2腦死亡前后兔MAP及HR變化

B組兔在誘導腦死亡過程中MAP和HR 隨顱內(nèi)間斷加壓呈現(xiàn)波浪狀升降變化，總體趨勢不斷升高。加壓前MAP和HR分別為(80.63±8.45) mmHg和(153.25±14.35) 次/min，球囊內(nèi)緩慢間斷注入生理鹽水(2.4±0.2) mL時，MAP和HR開始急劇升高，達到峰值(111.63±7.71) mmHg和(262.38±16.60) 次/min，峰值維持約(1.5±0.2) min后開始急劇下降，呼吸深慢，瞳孔先縮小后散大，直到自主呼吸停止，腦電圖靜息，連接動物呼吸機，同時應用血管活性藥物，誘導腦死亡后2 h為(50.13±2.59) mmHg。MAP峰值與加壓前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；腦死亡后2 h與加壓前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。B組峰值及腦死亡后2 h的MAP與A組對應時間點MAP的比較差異也具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。實驗全程MAP均維持在40 mmHg以上。誘導腦死亡過程中HR呈現(xiàn)升高趨勢。加壓前HR為(153.25±14.35) 次/min，加壓至腦死亡過程中峰值HR為(262.38±16.60) 次/min，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；腦死亡2 h后HR為(218.50±10.27) 次/min,與峰值HR(262.38±16.60) 次/min和加壓前HR比較差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。B組誘導腦死亡后的HR與A組對應時間點HR的比較差異也具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。A組行顱內(nèi)插管前后MAP及HR的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組與B組MAP各時間點對比見表1；A組與B組HR各時間點對比見表2。

2.3撤除搶救

動物脫離呼吸機和停止多巴胺滴注后血壓直線下降，約5 min后血壓壓差為零。

3討論

現(xiàn)階段，腦死亡的定義為枕骨大孔以上水平包括大腦、小腦和腦干等在內(nèi)的全腦功能完全地不可逆性損害[6]。腦死亡狀態(tài)超越昏迷狀態(tài)，即無自主呼吸，需要呼吸機維持，全身肌肉松弛，各種反射消失，低體溫及尿崩，但是心跳仍存在。概念重點強調(diào)全腦功能不可逆性損傷。生理學研究表明，機體的生命中樞即血壓和呼吸調(diào)節(jié)中樞位于腦干，血壓調(diào)節(jié)中樞通過改變心肌收縮力和心率來調(diào)節(jié)血壓變化，腦死亡研究過程中腦干會不可避免的遭受打擊，機體血壓、心率和呼吸會發(fā)生劇烈改變，所以監(jiān)測血壓和心率變化可直接反應腦死亡的發(fā)生過程。

表1　兩組兔實驗期間不同時間點MAP變化(mmHg)

注：與同組加壓前比較，差異有統(tǒng)計學意義，aP< 0.05；與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義，bP< 0.05。

Note：Compared to Pre-compression in group A,aP< 0.05; Compared to group B,bP< 0.05.

表2　兩組兔實驗期間不同時間點HR變化(次/min)

注：與同組加壓前比較，差異具有統(tǒng)計學意義，aP< 0.05；與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學意義，bP< 0.05。

Note：Compared to Pre-compression in group A,aP< 0.05; Compared to group B,bP< 0.05.

隨著國內(nèi)腦死亡器官捐獻的發(fā)展，有關(guān)腦死亡動物模型實驗研究應運而生。腦死亡模型的制作方法包括頸內(nèi)動脈結(jié)扎法、呼吸暫停法[7-8]、膜外加壓法、顱內(nèi)制造血腫法[9]、斷頭法等[10-11]。研究表明，大量原發(fā)性腦死亡病例的實踐報告中顯示90以上存在腦疝[6]，提示顱內(nèi)高壓可能是腦死亡重要發(fā)病機制。國外已有關(guān)于鼠、豬和犬腦死亡模型建立的報道[12-13]。因此參照相關(guān)文獻，本實驗采用改良的顱內(nèi)加壓法制作兔腦死亡模型，增加了模型制作過程中的可行性和成功率，并長時間維持腦死亡狀態(tài)。傳統(tǒng)方法相關(guān)文獻已有闡述，文中不再設立傳統(tǒng)術(shù)式組，與傳統(tǒng)方法比較，我們將模型制作過程及某些指標的監(jiān)測進行改進：首先我們選用木刻雕刀將顱骨刻出直徑0.5 cm大小孔徑，相關(guān)文獻報道使用顱鉆[4]，實踐表明顱鉆鉆孔不穩(wěn)定，兔尸體解剖發(fā)現(xiàn)其顱骨較薄，顱骨鉆容易破壞腦組織；其次由于心電圖描記心率時會受到較多干擾，所以其值波動較大很難反映出心率的真實變化，我們應用術(shù)中便攜超聲機行兔心臟彩超，最為準確的反應心率變化。

研究顯示，腦死亡誘導過程中MAP隨間斷顱內(nèi)加壓呈波浪狀升降，總體上升，當腦死亡誘導成功后驟然下降，具有特征性改變。與相關(guān)文獻報道相符[14]。通過呼吸機和多巴胺將MAP維持在45 mmHg；加壓過程中HR在加壓過程中升高明顯，迅速達到峰值。腦死亡誘導后心率有下降趨勢但仍高于加壓前，且維持到實驗結(jié)束。我們推測出現(xiàn)此結(jié)果可能有兩種原因：第一，機體控制心率的神經(jīng)中樞在延髓，靜息狀態(tài)下心率被迷走神經(jīng)抑制，當機體腦死亡后這種抑制關(guān)系解除，心率加快；第二，腦死亡誘導成功后兔血壓急驟下降，需要大量大巴按維持，而大劑量多巴胺可作用于β受體，因此心率加快[15]。但有待進一步研究。

本實驗目的在于探索一個具有可行性且成功率高的腦死亡模型制作以及腦死亡狀態(tài)維持的方法，為今后腦死亡供體器官質(zhì)量的評估研究提供穩(wěn)定的模型基礎(chǔ)。對于腦死亡狀態(tài)下器官功能、器官血流動力學及病理學方面的改變亟待進一步研究。

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〔修回日期〕2015-10-21

[基金項目]武警總部課題(WZ2014002)。

[作者簡介]潘宜鵬(1988-)，男，碩士，研究方向：肝臟移植方向。 [通訊作者]任秀昀(1970-)，女，博士，研究方向：超聲造影，E-mail: rrcloud@sina.com。

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0025-04

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.005

Establishment of brain death model for rabbits in a modified way by increasing intracranial pressure and maintaining the state of brain death

PAN Yi-peng1，LIU Yu1，LI Ming2，REN Xiu-yun3

(1. Department of Transplantation, the General Hospital of the Chinese People's Armed Police, Beijing 100039, China; 2.Medical department, the General Hospital of the Chinese People’s Armed Police, Beijing 100039, China; 3.Department of Ultrasound, the General Hospital of the Chinese People’s Armed Police, Beijing 100039, China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the modified increasing intracranial pressure method to set up the brain death model for rabbits and sustain the state of brain death. Methods15 healthy New Zealand rabbits were divided into brain death group (Group A，n=9) and sham operation group(Group B，n=6) randomly. The 9 brain death rabbits were set up by increasing intracranial pressure in a modified way. The sham operation rabbits were only sustained with anesthesia．Recorded the mean artery pressure (MAP) and heart rate (HR). ResultsIn group A, the 8 brain death rabbits were successfully set up. Only 1 died of heart failure. Compared to Group B, the MAP and HR of Group A rise up greatly during increasing intracranial pressure and presented an increasing trend. The peak MAP and HR were (111.63±7.71) mmHg and (262.38±16.60)beats/min which were much higher than the MAP(80.63±8.45) mmHg and HR(153.25±14.35) beats/min before increasing intracranial pressure(P < 0.05). After brain death, MAP decreased sharply to 45mmHg. 2 hours after brain death, HR (218.50±10.27) beats/min presented an decreasing trend too, which showed a significantly statistic difference to peak HR(262.38±16.60) and HR(153.25±14.35) beats/min before brain death(P < 0.05). Conclusions Compared to traditional method, the brain death model could be established stably and securely in the modified way and maintained for long time with the respiration and circulation supports.

【Key words】Brain death；Model establishing；Rabbits；Vital signs