王　瑋，余柄廷,李建芳，李彥涵，劉麗君，胡凝珠

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明　650118；2. 河北大學(xué)生命學(xué)院，河北 保定　071000；3.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明　650500)

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低分子量肝素鈉佐劑對(duì)甲型肝炎病毒疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響

王瑋1，余柄廷2,李建芳1，李彥涵1，劉麗君3，胡凝珠1

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明650118；2. 河北大學(xué)生命學(xué)院，河北 保定071000；3.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明650500)

【摘要】目的探討低分子量肝素鈉(low molecular weight heparin sodium，LMWH-Na)佐劑對(duì)甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響。方法將ICR小鼠隨機(jī)分成8組，6只/組，分別為甲型肝炎減毒活疫苗HepA-l (18 EU)與5種不同劑量(100 μL，20 μL，10 μL，1 μL，0.1 μL)的低分子量肝素鈉混合免疫小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，并取生理鹽水作為陰性對(duì)照組(Blank)、HepA-l (18 EU)作為陽性對(duì)照組、HepA-l混合 Al(OH)3(300 μg)作為鋁佐劑對(duì)照組，共免疫一次，于免疫后第 4、8、12、16周進(jìn)行尾靜脈采血,采用 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中抗 HAV 抗原特異性 IgG 抗體水平。在試驗(yàn)期間，對(duì)小鼠的健康狀況進(jìn)行觀察，并于免疫16周后，取低分子量肝素鈉最大劑量組100 μL組及生理鹽水組小鼠腎臟、脾臟、肝臟、肺臟、心臟各主要器官制作病理切片進(jìn)行對(duì)比觀察。結(jié)果 除陰性對(duì)照組外，各組小鼠免疫后第4周后均產(chǎn)生抗-HAV IgG，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)抗體水平逐漸升高，于第 8 周達(dá)到最高值，此后逐漸下降。同一時(shí)間不同組的抗體水平不同。其中，第4周，第8周，鋁佐劑對(duì)照組，低分子量肝素鈉100 μL組，低分子量肝素鈉20 μL組，低分子量肝素鈉10 μL組的抗體水平高于陽性對(duì)照組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)，第12周，鋁佐劑對(duì)照組，低分子量肝素鈉20 μL組和低分子量肝素鈉10 μL組的抗體水平高于陽性對(duì)照組(P < 0.05)，第16周，鋁佐劑對(duì)照組和低分子量肝素鈉10 μL組的抗體水平高于陽性對(duì)照組(P < 0.05)，但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，低分子量肝素鈉各組的抗體水平都低于鋁佐劑對(duì)照組的抗體水平。表明低分子量肝素鈉可增強(qiáng) HAV 抗原特異性體液免疫應(yīng)答，具有佐劑效應(yīng), 最佳劑量為10 μL/組，但其佐劑效應(yīng)低于鋁佐劑效應(yīng)。試驗(yàn)期間，各組小鼠均未出現(xiàn)異常。低分子量肝素鈉100 μL組小鼠腎、脾、肝、肺、心組織均未觀察到病變。結(jié)論低分子量肝素鈉可明顯增強(qiáng) HAV 抗原誘導(dǎo)小鼠的體液免疫應(yīng)答,具有成為新型疫苗佐劑的研發(fā)價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】低分子量肝素鈉；佐劑；甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)；體液免疫

肝素(heparin)是一種由動(dòng)物結(jié)締組織中的肥大細(xì)胞合成的黏多糖物質(zhì), 是一種天然抗凝血物質(zhì)。低分子量肝素(low molecular weight heparin, LMWH)是一類平均分子量為5×103的肝素, 臨床應(yīng)用的低分子量肝素鈉是利用化學(xué)或酶解方法由普通肝素制備的鈉鹽[1]。LMWH以及它的鈉鹽LMWH-Na在臨床上的作用主要是抗凝血，近年來，研究發(fā)現(xiàn)，LMWH以及它的鈉鹽LMWH-Na除了具有抗凝血作用外，還具有抗病毒，抗炎和抗癌的作用[1]。

LMWH和LMWH-Na的抗病毒作用

近年來研究發(fā)現(xiàn)LMWH以及其鈉鹽LMWH-Na對(duì)不同的病毒有抑制作用。顧小海等[2]發(fā)現(xiàn)，LMWH可以通過感染阻斷途徑和直接殺滅法抑制人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)，與更昔洛韋的抑制病毒增殖機(jī)制相互補(bǔ)，從而達(dá)到一個(gè)更好的治療效果。郭研楠等[3]發(fā)現(xiàn)LMWH可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)，阻斷其與腎臟靶細(xì)胞結(jié)合，有效的抑制RSV對(duì)大鼠腎細(xì)胞的感染, Frizelle等[4]發(fā)現(xiàn)LMWH 可降低柯薩奇病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)感染小鼠后的病死率。另外，LMWH對(duì)自然界多種病毒如單純皰疹病毒，人類免疫缺陷病毒及腺相關(guān)病毒等都有抑制作用。關(guān)于LMWH抗病毒的機(jī)制，很多學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道，主要的一種機(jī)制是硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)是很多病毒的共同受體，其特有的結(jié)構(gòu)決定了對(duì)病毒的特異性。HS是一種高度硫酸化的多糖，參與體內(nèi)很多生理過程，是糖胺聚糖參與病毒感染的最重要的結(jié)構(gòu)。另外，在生理?xiàng)l件下，HS帶有很多負(fù)電荷，可以與正電荷的病毒通過靜電作用結(jié)合識(shí)別，從而完成病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合，導(dǎo)致病毒感染，而LMWH有著類似HS的結(jié)構(gòu)，并帶有大量的負(fù)電荷，可與HS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合病毒，阻斷病毒的感染[2-3]。

LMWH和LMWH-Na抗炎作用

關(guān)于LMWH和其鈉鹽LMWH-Na的抗炎作用，目前有兩種不同的理論，一種是LMWH以及LMWH-Na的抗炎作用與其抗凝血作用相關(guān)[5]。相關(guān)研究表明，LMWH以及它的鈉鹽LMWH-Na的抗炎作用主要是通過與它特異性作用的凝血因子FXa[6]。FXa是一類能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的酶，其特異性受體是一類G蛋白偶聯(lián)受體-效應(yīng)器蛋白酶受體1(effector protease receptor-1，ERP1)，ERP1存在于多數(shù)白細(xì)胞中，此類白細(xì)胞與FXa結(jié)合后，會(huì)促進(jìn)自身分泌IL8,IL6,TNFα，從而激起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，而LMWH可通過作用于FXa阻斷其與ERP1的結(jié)合，從而發(fā)揮抗炎作用?？赡芡ㄟ^抗凝血機(jī)制達(dá)到抗炎結(jié)果的有下述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，一是韓紅等發(fā)現(xiàn)LMWH可以通過抑制細(xì)胞因子IL8和TNFα的表達(dá)從而抑制三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS)誘發(fā)大鼠結(jié)腸炎的炎癥現(xiàn)象，減輕腸粘膜的損傷[7]，二是celasco等[8]發(fā)現(xiàn)LMWH通過抑制IFNγ的表達(dá)水平來抑制由二硝基苯(dinitrobenzene，DNB)誘發(fā)的大鼠結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)。凝血反應(yīng)除FXa途徑引發(fā)炎癥外，凝血后體內(nèi)形成的血栓以及參與凝血過程的其他物質(zhì)也會(huì)引發(fā)炎癥，因此，LMWH以及LMWH-Na通過抗凝血作用來消除血栓也可起到抗炎作用[5]。另外，LMWH也可通過非抗凝血機(jī)制抗炎癥，例如，LMWH可以通過抑制非抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒起到抗炎的作用[9]。其機(jī)制可能為L(zhǎng)MWH和LMWH-Na中的肝素結(jié)構(gòu)作為三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3 )受體特異性拮抗劑, 可阻斷IP3 介導(dǎo)的肥大細(xì)胞(mast cell，MC)脫顆粒而引起的超敏反應(yīng)[10]，從而防止多形核白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞移出血管至炎癥處，從而抑制遲發(fā)型高敏反應(yīng)。

LMWH和LMWH-Na的抗癌作用

在抗癌作用方面，LMWH的作用也引起了很多學(xué)者的關(guān)注，Pross等[11]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，LMWH能顯著的抑制腹腔內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。陳公英等[12]發(fā)現(xiàn)LMWH對(duì)肝癌有一定的治療作用，其機(jī)制是LMWH可以抑制新生血管增生,抑制肝素酶活性以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

基于以上的這些有關(guān)LMWH以及LMWH-Na具有的抗病毒，抗炎以及抗癌等生理作用，我們認(rèn)為L(zhǎng)MWH和它的鈉鹽LMWH-Na有成為佐劑的潛力。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討LMWH-Na佐劑對(duì)甲型肝炎病毒疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響，以評(píng)價(jià)其佐劑效果。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠共48只，雌性，體重20～25 g，6～8周齡，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供【SCXK(滇)K2014-0002】。所有的操作均按照醫(yī)學(xué)生物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK(滇)K2014-0007】。

1.2主要試劑

甲型肝炎減毒活疫苗 HepA-l(抗原滴度為256 EU/mL)與HAV抗原由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；低分子量肝素鈉購(gòu)自昆明積大制藥有限公司；鋁佐劑為Al(OH)3膠體(12.5 mg/mL)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；小鼠血清IgG ELISA 試劑盒，購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物免疫

將48只雌性ICR小鼠隨機(jī)分成8組，6只/組。將不同劑量(100 μL，20 μL，10 μL，1 μL，0.1 μL)的LMWH-Na與 HepA-l(18 EU)混合，設(shè)置為L(zhǎng)MWH-Na不同劑量組，并設(shè)陰性對(duì)照組Blank組、陽性對(duì)照組、鋁佐劑對(duì)照組，均經(jīng)皮下注射ICR小鼠，200 μL/只。于免疫后的第4、8、12和 16 周，在小鼠尾靜脈部位采血，分離血清，以備檢測(cè)。見(表1)。1.3.2小鼠血清中抗-HAV IgG 抗體水平的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用間接 ELISA 法。取HepA-1抗原加入到96孔板中，100 μL/孔，并于濕盒中4℃包被過夜；用BSA 于37℃ 封閉1 h，200 μL/孔；拍凈板子后，加入 倍比稀釋的小鼠血清(起始稀釋倍數(shù)為1∶20)，100 μL/孔并于37℃封閉1 h；洗板4次后拍凈板子，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶400稀釋)，100 μL/孔，于37℃封閉1h；洗板4次，并拍凈板子后加入TMB顯色液，100 μL/孔，顯色10 min；加入2 mol/L H2SO4，100 μL/孔，終止顯色反應(yīng)，于酶標(biāo)儀405 nm和605 nm波長(zhǎng)處，檢測(cè)各孔A值，以陽性反應(yīng)的最大稀釋度作為樣品的抗體效價(jià)，根據(jù)ELISA結(jié)果計(jì)算各組的平均滴度，并以Log10 表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　動(dòng)物分組

注：A-第4周；B-第8周；C-第12周；D-第16周。a-空白組；b-陽性對(duì)照組；c-鋁佐劑對(duì)照組；d-低分子量肝素鈉100 μL組；e-低分子量肝素鈉20 μL組；f-低分子量肝素鈉10 μL組；g-低分子量肝素鈉1 μL組；h-低分子量肝素鈉0.1 μL組。圖1　不同時(shí)間各組小鼠血清抗-HAV IgG 水平Note:A-The 4 week；B-The 8 week；C-The 12 week；D-The 16 week.a-Blank group； b-Postive ncontrol group；c-Aluminium adjuvant control group；d-LMWH-Na 100 μL group；e- LMWH-Na 20 μL group；f- LMWH-Na 10 μL group；g-LMWH-Na 1 μL group； h- LMWH-Na 0.1 μL group.Fig.1　Anti-HAV IgG titers in sera of mice in different groups at 4,8,12 and 16 weeks

2結(jié)果

2.1各組小鼠血清中抗-HAV IgG 抗體水平

注：A-陰性對(duì)照組心臟；B-陰性對(duì)照組肝臟；C-陰性對(duì)照組脾臟；D-陰性對(duì)照組肺；E-陰性對(duì)照組腎；F-LMWH-Na最大劑量組(100 μL)心臟；G- LMWH-Na最大劑量組(100 μL)肝臟；H- LMWH-Na最大劑量組(100 μL)脾臟；I-LMWH-Na最大劑量組(100 μL)肺；J- LMWH-Na最大劑量組(100 μL)腎。圖2　陰性對(duì)照組和LMWH-Na 最大劑量組(100 μL)組小鼠各臟器組織的病理學(xué)觀察(HE染色，×20)Note:A- the heart of negative control; B-the liver of negative control; C-the spleen of negative control; D-the lung of negative control; E-the kidney of negative control; F-the heart of LMWH-Na Maximum dose group; G-the liver of LMWH-Na Maximum dose group; H-the spleen of LMWH-Na Maximum dose group; I-the lung of LMWH-Na Maximum dose group; J-the kidney of LMWH-Na Maximum dose group.Fig.2　Pathological changes in various organs of mice in negative control and LMWH 100 μL group(HE staining,×20)

除陰性對(duì)照組外，各組小鼠免疫后第4、8、12、16 周，均產(chǎn)生抗-HAV IgG，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)抗體水平逐漸升高，于第 8 周達(dá)到最高值，此后逐漸下降。其中，第4周，第8周，鋁佐劑對(duì)照組，LMWH-Na 100 μL組，LMWH-Na 20 μL組，LMWH-Na 10 μL組的抗體水平高于陽性對(duì)照組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LMWH-Na 1μL組和LMWH-Na 0.1 μL組的抗體水平也高于抗原對(duì)照組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第12周，鋁佐劑對(duì)照組，LMWH-Na 20 μL組和LMWH-Na 10 μL組的抗體水平高于陽性對(duì)照組(P<0.05)，雖然，LMWH-Na 100 μL組高于陽性對(duì)照組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而LMWH-Na 1 μL組和LMWH-Na 0.1 μL組的抗體水平低于陽性對(duì)照組。第16周，鋁佐劑對(duì)照組和LMWH-Na 10 μL組的抗體水平高于陽性對(duì)照組(P<0.05)，LMWH-Na 100 μL組，LMWH-Na 20 μL組雖然高于陽性對(duì)照組但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LMWH 1 μL組和LMWH-Na 0.1 μL組的抗體水平低于陽性對(duì)照組。但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，LMWH-Na各組的抗體水平都低于鋁佐劑對(duì)照組組的抗體水平。表明LMWH-Na可增強(qiáng) HAV 抗原特異性體液免疫應(yīng)答，具有佐劑效應(yīng)，最佳劑量為10 μL/組。見圖1。

2.2佐劑病理學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)期間，低分子量肝素鈉各組及對(duì)照組各小鼠情況良好，未出現(xiàn)體重降低，休克，精神不振，掉毛，死亡等現(xiàn)象；觀察病理切片發(fā)現(xiàn)低分子量肝素鈉最大劑量組100 μL組和生理鹽水對(duì)照組小鼠的腎臟、脾臟、肝臟、肺臟、心臟組織均無異常表現(xiàn)，見圖 2。說明低分子量肝素鈉具有良好的安全性。

3討論

佐劑是一類可以增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的物質(zhì)，尋找一種有效的新型疫苗除安全性高外，還應(yīng)該既能增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的體液免疫，也能增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫，并且價(jià)格合理。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)如今新型的疫苗佐劑層出不窮，但目前被認(rèn)證使用的寥寥無幾，鋁佐劑和流感疫苗佐劑MF59是兩種被批準(zhǔn)應(yīng)用于人類疫苗的佐劑，盡管如此，兩種佐劑仍然有著局限性，作為最廣泛使用的佐劑種類，鋁佐劑在安全性上還是存在著瑕疵，例如在注射部位上易誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)，形成結(jié)節(jié)等，更為嚴(yán)重的鋁佐劑有讓人體發(fā)生神經(jīng)退行性病變的可能[13]，在效用上，鋁佐劑對(duì)小分子量抗原免疫應(yīng)答的增強(qiáng)效果不夠理想[14],除此之外，鋁佐劑和MF59雖然可以有效的增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，但其在增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫方面效果仍然不明顯，因而其作為疫苗佐劑的效用有一定的缺陷，為了彌補(bǔ)現(xiàn)有佐劑的這種缺陷，研究人員做了很多的努力，包括根據(jù)toll 樣受體(Toll-like receptors，TLR)信號(hào)途徑的關(guān)鍵點(diǎn)作為靶點(diǎn)尋找有效的佐劑并發(fā)現(xiàn)了各種TLR激動(dòng)劑[15]，利用危險(xiǎn)模式理論去尋找內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)因子作為佐劑例如硫酸乙酰肝素[13]，還應(yīng)用復(fù)合佐劑去激發(fā)體內(nèi)的體液免疫和細(xì)胞免疫，但效果依然不佳，依然不能有效的誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫，因此，尋找一種新型的既能增強(qiáng)體液免疫又能增強(qiáng)細(xì)胞免疫的新型疫苗佐劑是目前研發(fā)疫苗佐劑的任務(wù)。

本實(shí)驗(yàn)將不同劑量的LMWH-Na與HAV疫苗混合免疫小鼠，以用來研究LMWH-Na作為佐劑對(duì)誘導(dǎo)小鼠體液免疫的效應(yīng)，旨在發(fā)現(xiàn)一種新型疫苗佐劑，結(jié)果表明，LMWH-Na可以有效增強(qiáng)小鼠的體液免疫應(yīng)答，且安全性良好，具有開發(fā)為新型疫苗佐劑的潛力，但其的佐劑效應(yīng)仍然不如鋁佐劑的佐劑效應(yīng)。另外，為了找到效果優(yōu)于鋁佐劑的佐劑，我們實(shí)驗(yàn)室還進(jìn)行了復(fù)合佐劑誘導(dǎo)體液免疫的研究，例如氫氧化鋅與低分子量透明質(zhì)酸復(fù)合佐劑對(duì)甲肝乙肝聯(lián)合抗原的體液免疫增強(qiáng)作用明顯高于鋁佐劑的佐劑效應(yīng)[16]，所以我們可以尋找一種可增強(qiáng)細(xì)胞免疫的佐劑與另一種可增強(qiáng)體液免疫的佐劑作為復(fù)合佐劑，與鋁佐劑的佐劑效應(yīng)以及安全性進(jìn)行比較,來尋找比鋁佐劑更易于誘導(dǎo)體液免疫并能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的佐劑組合。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金項(xiàng)目]國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2014BAI01B01)；云南省社會(huì)發(fā)展新藥專項(xiàng)(2013BC011)。

[作者簡(jiǎn)介]王瑋(1988-)，女，碩士生，專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 [通訊作者]胡凝珠(1961-)，女，主任技師。E-mail: huningz@126.com。

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 01-0019-06

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.004

Effects of low molecular weight heparin sodium adjuvant on humoral immune response induced by Hepatitis A virus vaccine in mice

WANG Wei1，YU Bing-ting2， LI Jian-fang1，LI Yan-han1，LIU Li-jun3，HU Ning-zhu1

(1.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Kunming 650118， China；2.Hebeiuniversity，Hebei Baoding 071000，China；3. Kunming Medical University，Kunming 650500，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Low molecular weight heparin sodium (LMWH-Na) adjuvant on humoral immune response induced by hepatitis A virus(HAV)vaccine in mice. MethodsICR mice were randomly divided into 8 groups, six for each, and the mouse of each group are injected respectively with live attenuated hepatitis A vaccine HepA-1(18 EU) +different doses (100 μL, 20 μL, 10 μL, 1 μL, 0.1 μL) of LMWH-Na, while those injected with physiological saline as a negative control group (Blank), those injected with HepA- 1(18 EU) as positive control group, those injected with Al(OH)3(300 μg)+HepA-1(18 EU) as the aluminium adjuvant control group, 200μL for each. The specific IgG level against HAV in sera of mice at weeks 4, 8, 12 and 16 after immunization were determined by indirect ELISA. During the experiment, the health status of the mice were observed, the kidney, spleen, liver, lung and heart of mice immunized with LMWH-Na 100 μL at the maximum dosage and those in negative control group were taken out at week 16 after immunization, and prepared into sections for pathological observation. ResultsIn addition to the negative control group, mice in various group produced anti -HAV IgG at 4 weeks after the immunization, of which the levels increased as time went on, and reached peak values at week 8 then decreased gradually. At 4 week and 8 week, the anti -HAV IgG levels of aluminum adjuvant control group, LMWH-Na 100 μL group, LMWH-Na 20μL group, LMWH-Na 10 μL group were higher than the positive control group and the difference was statistically significant (P < 0.05). At 12 week, the anti -HAV IgG levels of aluminum adjuvant control group, LMWH-Na 20 μL group and LMWH-Na 10 μL group were higher than the positive control group and the difference was statistically significant (P < 0.05). 16 week，the anti -HAV IgG levels of aluminum adjuvant control group and LMWH-Na 10 μL group were higher than positive control group and the difference was statistically significant (P < 0.05)，but the anti-HAV IgG levels of various LMWH-Na groups were lower than the aluminum adjuvant control group. ConclusionsLMWH-Na can obviously enhance the HAV antigen induced humoral immune response in mice,and have a value of becoming a new type of vaccine adjuvant.

【Key words】Low molecular weight heparin sodium(LMWH-Na)；Adjuvant；Hepatitis A virus vaccine；Humoral immunity