陳苗苗 董金杰 杜 平 王超英 （中農(nóng)威特生物科技股份有限公司 甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫(Foot-and-mouth disease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus， FMDV)引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和快速遠(yuǎn)距離傳播的疫病，目前對患病牲畜尚無有效的治療方法，只有使用口蹄疫疫苗接種動物進(jìn)行積極預(yù)防[1]。常規(guī)滅活疫苗仍然是當(dāng)前FMD免疫控制采用的主要疫苗，又以法國SEPPIC公司的ISA206雙相油佐劑疫苗為市場主導(dǎo)疫苗，隨著疫苗技術(shù)的發(fā)展，新型佐劑成為現(xiàn)在研究的熱點，尤其以納米佐劑和凝膠佐劑為主，該新型載體穩(wěn)定、安全、靶向、緩釋等優(yōu)點克服了普通疫苗的缺點[2，3]，本研究通過三組新型疫苗載體配制的疫苗，以常規(guī)206佐劑乳化配制的疫苗作對照，較全面比較評價四組佐劑配制的疫苗物理性狀和小鼠體液免疫應(yīng)答水平，為以后的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原與佐劑 （1）抗原：口蹄疫O型滅活抗原(本公司生產(chǎn)部提供)。（2）佐劑：IMS1313納米佐劑(SIPPIC公司提供)、M12納米乳佐劑(本部門研制)、HA凝膠佐劑(佳木斯大學(xué)材料學(xué)院提供)、ISA206油佐劑(SEPPIC公司提供)。

1.1.2 儀器與試劑 磁力攪拌器(德國IKA)、激光粒度分析儀(美國貝克曼)、臺式高速微量離心機(jī)(賽默飛世爾)、酶標(biāo)儀(購自博樂公司)、口蹄疫血清抗體檢測ELISA試劑盒(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳化 IMS1313納米佐劑、M12納米乳佐劑、HA凝膠佐劑、ISA206油佐劑分別121℃高壓滅菌30min，同一批次口蹄疫O型抗原無菌分裝四份，146s為10ug/ml。IMS1313納米佐劑、M12納米佐劑分別在室溫下與該抗原按質(zhì)量比1：1預(yù)混合，磁力攪拌器1000r/min乳化5min，分裝10ml鏈瓶中。ISA206佐劑與該抗原(30±2)℃水浴30min，按質(zhì)量比1：1預(yù)混合，磁力攪拌器1000r/min乳化5min，分裝10ml鏈瓶中。該抗原做2倍稀釋后與HA凝膠佐劑按質(zhì)量比6：1預(yù)混合，磁力攪拌器1000r/min乳化5min，分裝10ml鏈瓶中。

1.2.2 性狀檢測 按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行性狀檢驗。粘度檢測：用1ml吸管(出口內(nèi)經(jīng)1.2mm)分別吸取25℃疫苗，垂直自然流出，計算0.4ml流出所需要的時間。離心檢測：用10ml離心管加入10ml疫苗，以3000r/min離心30min。劑型檢測：取一潔凈吸管，分別吸取四組疫苗。滴于25℃無離子水表面，第一滴下部呈拖尾狀或部分分散為水包油包水，若疫苗在水中迅速擴(kuò)散溶于水中即為水劑。粒度檢測：用1ml吸管吸取疫苗滴于粒度儀樣品池中3滴，按預(yù)先設(shè)置好的參數(shù)，讀取粒度值。穩(wěn)定性放置試驗：疫苗分別存放在4、25、37℃，放置3、7、30、90、180、365d。觀察穩(wěn)定性情況。

1.2.3 小鼠免疫試驗 （1）血清特異性IgG檢測：將滅活抗原分別與ISA206佐劑、IMS1313佐劑、HA凝膠佐劑以及M12納米佐劑乳化的疫苗，分別免疫20g雌性BALB/C小鼠10只，免疫劑量為0.5ml[4]，分別在免疫后每隔7天斷尾靜脈采血，共計90d，用口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒檢測血清抗體，初步測定四組佐劑乳化的疫苗對小鼠的免疫抗體水平以及消長情況。（2）數(shù)據(jù)統(tǒng)計：試驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)釆用SPSS(11.5)軟件進(jìn)行One-way ANOVA中的LSD分析方法進(jìn)行組間多重比較，以P＜0.05為差異顯著，采用Microsoft Office Excel 2003軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

試驗結(jié)果見表1。

表1 4組佐劑配制疫苗的物理性狀檢測結(jié)果比較

2.1 物理性狀檢測

4種佐劑分別與口蹄疫O型滅活抗原乳化配制疫苗，物理性狀檢測結(jié)果均達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，納米乳M12佐劑乳化的疫苗與206佐劑乳化的疫苗都是雙相W/O/W疫苗，M12佐劑乳化的疫苗粒徑為納米級小于100nm，206佐劑乳化的疫苗粒徑為微米級，2.13um，離心檢測均未出現(xiàn)明顯分層，粘度檢測均在2～8s的容許范圍，商用納米佐劑IMS1313、羥基磷灰石HA凝膠佐劑配制的疫苗為水溶液，離心檢測溶液澄清均一。

2.2 放置試驗

4種佐劑乳化的疫苗放置在25℃、4～8℃以及37℃，觀察疫苗分層情況，在4℃以及25℃，四組疫苗均未出現(xiàn)明顯分層，37℃自制的M12佐劑配制的疫苗和商用IMS1313佐劑、HA凝膠佐劑配制的疫苗均未出現(xiàn)明顯分層，ISA206佐劑乳化的疫苗出現(xiàn)明顯分層。

2.3 對小鼠的免疫試驗

4種佐劑與同批O型口蹄疫滅活抗原配制的疫苗分別免疫10只BALB/C小鼠，用液相阻斷ELISA方法測定O型抗體效價，并計算Log10(效價)對照值求平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，抗體結(jié)果如下表：

表2 4組佐劑配制的疫苗免疫90d的抗體結(jié)果

表2結(jié)果顯示，4組疫苗在免疫后28d抗體水平均達(dá)到最高值，自制M12納米佐劑疫苗組均值為2.75，IMS1313納米佐劑疫苗組為2.56，HA凝膠疫苗組為1.51，ISA206佐劑疫苗組為2.72，90d后，M12納米佐劑疫苗組降到2.31，IMS1313納米佐劑疫苗組降到0.64，HA凝膠疫苗組降到0.49，ISA206佐劑疫苗組降到1.58.結(jié)果見附圖。

附圖 4種佐劑配制的疫苗90d內(nèi)血清平均抗體效價消長情況

從附圖中可以看出，自制M12佐劑配制的疫苗平均抗體均高于其他3組，能顯著提高小鼠血清中FMDV特異性IgG水平(P＜0.05)。

3 討論

（1）本試驗對適用于口蹄疫生產(chǎn)的疫苗佐劑包括自制納米乳佐劑M12、法國賽彼克公司的納米佐劑IMS 1313、ISA206以及HA凝膠佐劑的乳化效果進(jìn)行了評價。自制納米乳佐劑M12為納米級水包油包水佐劑，IMA1313為復(fù)合水溶性納米佐劑，ISA206佐劑為常規(guī)水包油包水佐劑，HA凝膠佐劑為吸附性顆粒物佐劑，選擇這四種不同類型的佐劑考察它們的乳化效果。水包油包水乳劑粘度低，并且能提高短期和長期的免疫反應(yīng)。水包油包水乳劑通常誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[5]。外部水相中的抗原可立即作用于免疫系統(tǒng)，而內(nèi)部水相的抗原就像在油包水乳劑中一樣緩慢釋放。而納米佐劑疫苗粒徑小、分散性好、比表面積大，易于體內(nèi)吸收，能提高藥物生物利用度，能顯著提高細(xì)胞免疫應(yīng)答[6，7]，本實驗室研制的納米乳佐劑M12具備了水包油包水佐劑和納米佐劑的優(yōu)點，能更好的適用于口蹄疫疫苗中。本試驗通過劑型、粘度、離心、粒徑檢測以及放置試驗，較全面了解了這四種不同類型的口蹄疫疫苗佐劑的物理性狀及穩(wěn)定性，為以后應(yīng)用于口蹄疫生產(chǎn)提供理論依據(jù)，試驗結(jié)果顯示，這四種佐劑疫苗均達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（2）四種佐劑分別與同批次O型滅活抗原乳化配制疫苗免疫BALB/C小鼠，分別在免疫后90d內(nèi)每隔7d進(jìn)行斷尾靜脈采血，其血清用液相阻斷ELISA方法檢測，比較IgG抗體水平差異以及消長情況。自制納米乳佐劑M12乳化的疫苗平均抗體水平最高，且在90d內(nèi)維持在2.1的較高水平，賽比克公司的IMS1313納米佐劑以及ISA206雙相油佐劑乳化的疫苗平均抗體水平次之，且在28d達(dá)到較高水平值2.7(1：512)，28d以后下降明顯，IMS1313降幅比ISA206佐劑疫苗大，這與該佐劑的劑型有關(guān)[8]，由于納米顆粒佐劑疫苗為水溶性物質(zhì)，雖然能較快的產(chǎn)生抗體，但緩釋和控釋的作用較弱[9]，HA凝膠佐劑疫苗90d內(nèi)無明顯變化，IgG抗體水平均最低，不能很好的達(dá)到免疫效果。比較四種佐劑，自制納米乳佐劑M12乳化的疫苗平均抗體效價最高且長效[10，11]。