耿婷婷，汪婷婷，姜?jiǎng)欧?，徐旺芳，榮長保

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京　210029)

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足底電擊應(yīng)激時(shí)程對(duì)大鼠焦慮樣行為的影響

耿婷婷，汪婷婷，姜?jiǎng)欧?，徐旺芳，榮長保

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210029)

【摘要】目的觀察足底電擊應(yīng)激時(shí)程對(duì)大鼠高架十字迷宮及開場實(shí)驗(yàn)焦慮樣行為的影響。方法選取成年雄性SD大鼠按照體重分層隨機(jī)分為對(duì)照組和足底電擊組，每組12只。足底電擊組予以不可逃避性足底電擊(0.8 mA，電擊10 s，休息20 s，共5 min，1次/d)結(jié)合孤養(yǎng)建立大鼠焦慮模型。分別在足底電擊7 d及14 d后測高架十字迷宮和開場實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠的焦慮行為。結(jié)果7 d及14 d足底電擊后，足底電擊組焦慮樣行為增加，差異具有顯著意義(P<0.01)，入臂總次數(shù)明顯低于對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)活性降低。開場實(shí)驗(yàn)足底電擊組進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)及中心區(qū)逗留時(shí)間低于對(duì)照組(P<0.01)，運(yùn)動(dòng)總距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù)足底電擊組均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，運(yùn)動(dòng)探索活性降低。比較7天及14天足底電擊組行為學(xué)結(jié)果，可見隨著造模天數(shù)的增加，大鼠閉臂時(shí)間比及閉臂次數(shù)比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P<0.05)，焦慮程度降低。開場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù)14 d低于7 d，差異具有顯著性(P<0.05)，提示大鼠運(yùn)動(dòng)探索行為進(jìn)一步減少，自我關(guān)注度降低，抑郁樣行為增加。結(jié)論 不同時(shí)程的足底電擊應(yīng)激導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為，影響大鼠運(yùn)動(dòng)探索活性。隨著造模天數(shù)的增加，大鼠行為可能從焦慮樣向抑郁樣改變。足底電擊應(yīng)激焦慮模型造模時(shí)程的選擇7 d優(yōu)于14 d。

【關(guān)鍵詞】焦慮；動(dòng)物模型；足底電擊；行為學(xué)

焦慮障礙在現(xiàn)今社會(huì)非常普遍，病程緩慢，與眾多負(fù)面結(jié)果相關(guān)，如自殺風(fēng)險(xiǎn)更大，合并內(nèi)科病，并且當(dāng)與抑郁共病緩解率低[1]。焦慮障礙的研究需要?jiǎng)游锬Ｐ偷闹С?。雖然嚙齒類動(dòng)物焦慮樣行為與人類臨床焦慮定義有所區(qū)別，二者相似的受累腦區(qū)，以及人類抗焦慮藥物對(duì)嚙齒類動(dòng)物行為學(xué)的改善，說明嚙齒類動(dòng)物焦慮樣行為的研究可以對(duì)人類的焦慮問題研究提供線索[2]。

應(yīng)激在神經(jīng)變性疾病和精神疾病相關(guān)的眾多病理生理過程中扮演重要角色[3]。過度的應(yīng)激反應(yīng)與焦慮相關(guān)[4]。已有研究顯示短期的慢性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為[5]。足底電擊應(yīng)激是經(jīng)典應(yīng)激方式的一種，廣泛地應(yīng)用于條件恐懼相關(guān)研究[6-7]。焦慮與恐懼關(guān)系密切[8]，已有不少研究采用不可避免足底電擊應(yīng)激制造焦慮抑郁動(dòng)物模型[9-10]。但目前缺少不同時(shí)程的足底電擊應(yīng)激對(duì)大鼠焦慮樣行為影響的研究。我們將成年SD大鼠足底電擊不同時(shí)程后，觀察不同程度的慢性應(yīng)激刺激對(duì)大鼠高架十字迷宮及開場實(shí)驗(yàn)所示焦慮樣行為的影響，目的是尋找到足底電擊焦慮模型的最佳造模時(shí)間節(jié)點(diǎn)，為研究典型焦慮樣行為提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物及分組

SPF級(jí)SD雄性大鼠24只，體重為200～220 g, 6周齡，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心(西普爾-必凱)提供【SCXK(滬)2013-0016】。動(dòng)物飼養(yǎng)在大鼠通風(fēng)鼠籠中，環(huán)境溫度控制在21～23℃，濕度為 50% 左右，食水自由。實(shí)驗(yàn)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(蘇)2014-0001】內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守我國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，按體重分層隨機(jī)分為對(duì)照組(control group,12只)、足底電擊組(footshock group，F(xiàn)S，12只)。1.1.2儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)器材：足底電擊箱(SLY-SRC刺激記錄控制器，北京碩林苑科技有限公司)；大鼠通風(fēng)鼠籠(EVC，蘇州猴皇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技有限公司)；動(dòng)物行為錄像及分析采用TopScan-動(dòng)物行為智能分析系統(tǒng)(Cleversys，America)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)方案

為避免大鼠間氣息交流影響情緒狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)足底電擊組均采用孤養(yǎng)，大鼠通風(fēng)鼠籠設(shè)備可避免大鼠間氣息交流。對(duì)照組群養(yǎng)，每日撫摸數(shù)分鐘，余不作任何處理。足底電擊組每日接受一次足底電擊，電擊參數(shù)：0.8 mA，電擊10 s，休息20 s，共5 min。在足底電擊7 d及14 d后測高架十字實(shí)驗(yàn)(10:00～12:30)、開場實(shí)驗(yàn)(14:00～15:00)，評(píng)估大鼠的焦慮行為。

1.2.2高架迷宮實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮(Elevated plus maze，EPM)裝置(TopScan-動(dòng)物行為智能分析系統(tǒng)，Cleversys，America)由兩條相對(duì)開放臂(50 cm×l0 cm)和兩條相對(duì)閉合臂(50 cm×l0 cm×40 cm)及中央?yún)^(qū)(10 cm×l0 cm)連接而成，距離地面50 cm。實(shí)驗(yàn)前將大鼠搬至實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1 h以上，保持室內(nèi)安靜，暗光。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將大鼠從中央格面向閉合臂放入迷宮，記錄5 min內(nèi)的活動(dòng)情況。觀察大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)及停留時(shí)間。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出，將各臂清理干凈，并用75%的酒精去除氣味。行為學(xué)結(jié)果(1)閉臂時(shí)間比=閉臂時(shí)間/(開臂時(shí)間+閉臂時(shí)間)；(2)閉臂次數(shù)比=閉臂次數(shù)/(開臂次數(shù)+閉臂次數(shù))。(3)入臂總次數(shù)=閉臂次數(shù)+開臂次數(shù)。行為學(xué)結(jié)果應(yīng)用SPSS軟件箱式圖法剔除離群值。1.2.3開場實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)敞箱長×寬×高為：100 cm×100 cm×40 cm，內(nèi)面及底面均為藍(lán)色，中央?yún)^(qū)正上方安置攝像頭。實(shí)驗(yàn)第8天及第15天時(shí)，每組大鼠分別進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前把動(dòng)物提前1 h搬進(jìn)測試室適應(yīng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)開始后，將大鼠放到中央?yún)^(qū)固定位置，每次放置頭部固定朝向一側(cè)。每只大鼠測量5 min，測量指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)、直立次數(shù)及理毛次數(shù)，隨后用75%酒精清潔箱內(nèi)環(huán)境，等酒精揮發(fā)無味后，再進(jìn)行下1只。

1.3數(shù)據(jù)分析

2結(jié)果

2.1高架十字迷宮行為學(xué)結(jié)果比較

足底電擊組閉臂次數(shù)比、閉臂時(shí)間比均較對(duì)照組明顯增加，入臂總次數(shù)低于對(duì)照組(P<0.01)，顯示足底電擊致大鼠焦慮樣行為，導(dǎo)致大鼠運(yùn)動(dòng)活性下降。14 d與7 d比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，足底電擊組14 d閉臂次數(shù)比及閉臂時(shí)間比較7 d降低(P<0.05)，對(duì)照組兩時(shí)間點(diǎn)無差異。

2.2 開場行為學(xué)結(jié)果

足底電擊7 d和14 d與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)程對(duì)比，中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間及運(yùn)動(dòng)總距離顯著低于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)。足底電擊14 d與足底電擊7 d相比，運(yùn)動(dòng)總距離進(jìn)一步下降，大鼠直立次數(shù)及理毛次數(shù)顯著減少(P<0.05)，而中央?yún)^(qū)停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)兩電擊天數(shù)之間的差異不大。對(duì)照組兩時(shí)間點(diǎn)比較，除理毛次數(shù)外，其余開場行為學(xué)結(jié)果未見明顯差異。

Tab.1Comparison of rat's behavior in the elevated plus maze of different footshock-stress duration

時(shí)程Duration閉臂次數(shù)比CE%(thepercentageofentriestotheclosearm)閉臂時(shí)間比CT%(thepercentageoftimespentintheclosearm)入臂總次數(shù)TotalentriesFS7d 7days(FSgroup)0.85±0.13**0.95±0.05**10.11±5.82**對(duì)照組7d 7days(controlgroup)0.52±0.080.47±0.1328.5±5.01FS14d 14days(FSgroup)0.68±0.10**#0.81±0.14**#14±8.17*對(duì)照組14d 14days(controlgroup)0.51±0.070.49±0.1332.4±9.79

注：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)程相比，*P<0.05，**P<0.01；與足底電擊7 d相比，#P<0.05。

Note：*P<0.05，**P<0.01,compared with the corresponding duration(control group)；#P<0.05, compared with 7 days(FS group).

Tab.2Comparison of rat's behavior in the open-field test of different footshock-stress duration

時(shí)程Duration運(yùn)動(dòng)總距離(cm)Totalmovementdistance中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)Entrancetimestothecentralzone中央?yún)^(qū)停留時(shí)間(s)Retentiontimeinthecentralzone直立次數(shù)Numbersofrears理毛次數(shù)NumbersofgroomingFS7d7days(FSgroup)374.75±210.62*1.87±1.64**2.94±2.84**8.8±5.07**2.75±1.83**對(duì)照組7d7days(controlgroup)640.55±216.526.89±2.5714.1±3.5317.2±2.8610±2.24FS14d14days(FSgroup)220.44±191.31*#1.25±1.04**2.49±2.35**4.5±3.17**#1.2±1.03**#對(duì)照組14d14days(controlgroup)579.69±381.195.78±2.2210.33±4.7119.86±3.803.86±1.57

注：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)程相比，*P<0.05，**P<0.01；與足底電擊7 d相比，#P<0.05。

Note：*P<0.05，**P<0.01,compared with the corresponding duration(control group)；#P<0.05, compared with 7 days(FS group).

3討論

關(guān)于如何建立起較為合理的焦慮動(dòng)物模型，目前應(yīng)用的造模方法有很多種，包括：高架十字迷宮、空瓶刺激、天敵暴露、飲水沖突等等，但是仍然存在很多不確定因素和干擾因素[5]。應(yīng)激是精神疾病的重要基礎(chǔ)，與焦慮抑郁密切相關(guān)[3]，慢性應(yīng)激焦慮模型可作為焦慮模型的一種[5]。

應(yīng)激的不同時(shí)程影響動(dòng)物行為，急性應(yīng)激時(shí),動(dòng)物的活動(dòng)增加,但是隨應(yīng)激時(shí)間的延長,動(dòng)物的行為活動(dòng)逐漸減少,表現(xiàn)為由興奮焦慮狀態(tài)過渡到壓抑抑郁狀態(tài)[11]。應(yīng)激發(fā)生的不同時(shí)期(新生期或成熟期)以及不同時(shí)程對(duì)腦結(jié)構(gòu)功能、行為、認(rèn)知產(chǎn)生不同的效應(yīng)[12]，這種影響與應(yīng)激所致機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌改變相關(guān)[13]。分別于強(qiáng)迫游泳應(yīng)激第1,3,7,14和28天觀察應(yīng)激對(duì)大鼠海馬谷氨酸、天冬氨酸及γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)含量的影響，結(jié)果顯示第3天開始海馬興奮性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量持續(xù)增高，興奮性氨基酸拮抗劑GABA含量在急性應(yīng)激時(shí)降低，于14 d后開始增高[14]。金玉祥等[15]的研究發(fā)現(xiàn)在不同足底電擊應(yīng)激時(shí)程，大鼠腦內(nèi)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化：應(yīng)激早期(1～6 d)NOS陽性神經(jīng)元的核團(tuán)數(shù)目增多,NOS活性增加；隨著應(yīng)激時(shí)程延長，陽性核團(tuán)數(shù)目逐漸減少，15 d時(shí)眾多腦區(qū)的NOS表達(dá)較前明顯下降。基于以上，慢性應(yīng)激焦慮模型需要把握應(yīng)激時(shí)程。焦慮與抑郁往往伴發(fā)出現(xiàn)，焦慮反應(yīng)和抑郁反應(yīng)之間可能僅僅存在一個(gè)時(shí)間跨度，短期的刺激可以導(dǎo)致焦慮，而在此基礎(chǔ)上的延長刺激則可導(dǎo)致抑郁發(fā)生[5]。比較大鼠7 d、14 d以及21 d行為學(xué)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)14 d慢性束縛應(yīng)激大鼠主要表現(xiàn)為焦慮狀態(tài)，而21 d大鼠則主要以抑郁為主[16]。綜合之前的各項(xiàng)研究，我們選擇7 d及14 d這兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察足底電擊應(yīng)激時(shí)程對(duì)大鼠焦慮樣行為的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用高架十字迷宮及開場實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)足底電擊應(yīng)激所致大鼠焦慮樣行為，基于引起焦慮因素，例如未受保護(hù)的、升高的區(qū)域或一個(gè)開放區(qū)域，焦慮水平被表達(dá)為進(jìn)入?yún)拹簠^(qū)域的次數(shù)及逗留時(shí)間[17]。除此以外，高架十字迷宮的入臂總次數(shù)，開場的運(yùn)動(dòng)總距離及直立次數(shù)可以表征大鼠運(yùn)動(dòng)活性及探索欲望[18]，理毛次數(shù)反映大鼠對(duì)自己的關(guān)注度，大鼠運(yùn)動(dòng)探索及自我關(guān)注的下降，一定程度上反映大鼠抑郁樣行為[19-20]。已有研究表明間隔一周的兩次高架及開場實(shí)驗(yàn)主要指標(biāo)在初測及復(fù)測實(shí)驗(yàn)中均呈較好相關(guān)性及較好復(fù)測信度[21-22]，可以認(rèn)為大鼠對(duì)高架十字迷宮及開場實(shí)驗(yàn)的適應(yīng)和記憶效應(yīng)并未太大影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究足底電擊組在高架十字迷宮及開場實(shí)驗(yàn)中均顯示出對(duì)開放區(qū)域的回避，表現(xiàn)為閉臂停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)的增多，開場中心區(qū)探索時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)的減少，焦慮樣行為顯著。與此同時(shí)，入臂總次數(shù)、開場運(yùn)動(dòng)總距離、直立及自我修飾次數(shù)較對(duì)照組也顯著降低，顯示明顯抑郁樣行為。比較不同造模時(shí)間，我們還觀察到隨著足底電擊應(yīng)激時(shí)程的增加，大鼠焦慮樣行為減輕，抑郁程度加重。

綜上所述，足底電擊結(jié)合孤養(yǎng)可致大鼠焦慮樣行為，可作為慢性應(yīng)激焦慮模型的一種。 14 d大鼠的焦慮程度較7 d有所下降，然而大鼠運(yùn)動(dòng)探索活性及自我關(guān)注度進(jìn)一步降低，抑郁樣行為增加。可以認(rèn)為足底電擊應(yīng)激焦慮模型造模時(shí)程的選擇，7 d較14 d更優(yōu)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從行為學(xué)角度進(jìn)一步支持應(yīng)激時(shí)程影響動(dòng)物焦慮抑郁樣行為的觀點(diǎn)，研究應(yīng)激相關(guān)精神疾病應(yīng)重視應(yīng)激的時(shí)程、強(qiáng)度以及應(yīng)激類型的差別，這與臨床實(shí)際情況更加接近，并且時(shí)程影響背后的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373747)。

[作者簡介]耿婷婷(1990-)，女，碩士生。研究方向：針灸效應(yīng)規(guī)律及其機(jī)制研究。 [通訊作者]姜?jiǎng)欧?1967-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：針灸效應(yīng)規(guī)律及其機(jī)制研究。

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 01-0069-05

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.013

The influence of footshock stress duration on anxiety-like behavior in rats

GENG Ting-ting，WANG Ting-ting，JIANG Jin-feng，XU Wang-fang，RONG Chang-bao

(Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of footshock (FS) -stress duration on anxiety-like behavior in the elevated plus-maze and open-field tests. MethodsRats (24) were randomly divided into 2 groups: the control group and the FS group. In the FS group, the anxiety model of rat was produced by inevitability footshock (5 minutes in total, once a day; 0.8mA, lasted for 10 seconds, 20 seconds interval) combined with separation. Anxiety-like behavior was evaluated by elevated plus maze and open-field tests after 7 and 14 days of FS-stress. ResultsAfter 7 days and 14 days of FS-stress, FS group showed significantly enhanced anxiety-like behavior and reduced locomotion indicated by total entries as compared to the control group (P<0.01). In the open field test, the entrance times and the retention time in the central zone, the total movement distance, the numbers of rears and grooming in rats in the FS group were lower than those in the control group, which showed lower locomotion and exploratory activity in the FS groups (P<0.01，P<0.05).Compared to 7 days of FS-stress, both CT% (the percentage of time spent in the close arm) and CE% (the percentage of entries to the close arm) were reduced after 14 days of FS-stress showing the decreasing anxiety (P<0.05), as well as the total movement distance and the numbers of rears and grooming (P<0.05). The reduced locomotion and exploratory activity and self-regarding in the FS group demonstrated the enhanced depression-like behavior in rats.ConclusionsChronic FS-stress contributes to lower locomotion and exploratory activity in rats and leads to anxiety-like behavior in rats. The increased duration of chronic FS-stress may lead to the behavior change from anxiety-like behavior to depression-like behavior, and 7-days is better than 14-days in making the anxiety model in rats.

【Key words】Anxiety; Animal model; Footshock; Behavior