陳伯叢王汝上羅德祥（.廣東省佛山市中醫(yī)院　佛山　528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司　廣州　50530）

不同產(chǎn)地黃芪總黃酮HPLC指紋圖譜研究

陳伯叢1王汝上2*羅德祥1（1.廣東省佛山市中醫(yī)院佛山528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司廣州510530）

摘要：目的：建立黃芪總黃酮的HPLC指紋圖譜分析方法，評(píng)價(jià)不同來(lái)源藥材的質(zhì)量。方法：采用二極管陣列檢測(cè)器，色譜柱為AglientExtend C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。結(jié)果：建立14個(gè)共有特征峰的HPLC指紋圖譜，方法學(xué)考察結(jié)果符合指紋圖譜技術(shù)要求。結(jié)論：該方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可結(jié)合含量測(cè)定用于全面控制黃芪的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：黃芪 總黃酮 高效液相色譜 指紋圖譜

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge的干燥根，春、秋二季采挖，除去須根及根頭，曬干，具有補(bǔ)氣固表、利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌的作用，臨床用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、癰疽難潰、久潰不斂、血虛痿黃、內(nèi)熱消渴、慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等癥［1］。黃芪在我國(guó)分布廣泛，主要分布于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、陜西等地。研究表明，黃芪主要化學(xué)成分有黃酮（毛蕊異黃酮、芒柄花素及其糖苷等）、皂苷（黃芪皂苷、異黃芪皂苷、乙?；S芪皂苷及大豆皂苷Ⅳ）及多糖等，具有以下藥理及臨床應(yīng)用：黃酮能通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、凋亡和炎癥，保護(hù)血管內(nèi)皮免受糖尿病損傷；多糖具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、治療代謝紊亂等作用，能改善糖尿病腎病癥狀；黃芪皂苷具有降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、防治心肌損傷等作用，能抑制糖尿病患者視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變的進(jìn)程，對(duì)糖尿病并發(fā)癥有預(yù)防作用［2～6］。

不同產(chǎn)地的黃芪之間的總黃酮含量相差較大，目前對(duì)黃芪質(zhì)量控制較為單一，無(wú)法全面反映黃芪藥材質(zhì)量。本研究采用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地的黃芪進(jìn)行指紋圖譜研究，并建立方法，為全面、有效控制黃芪藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器：Agilent 1260液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）；超純水系統(tǒng)（Millipore公司）；電子天平（Sartorius，BT-25S）；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）

1.2材料：乙腈（色譜純，Merck），水為超純水，其他試劑為分析純。黃芪對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120974-201311）；黃芪藥材采于產(chǎn)地或購(gòu)于藥材市場(chǎng)，詳見表1。

2方法

2.1供試品溶液的制備：取黃芪藥材2.5g，精密稱定，加入40mL 的70%乙醇回流提取1次，每次3h，濾過(guò)，加70%乙醇定容至100mL，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2對(duì)照品溶液的制備：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品10mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3色譜條件：色譜柱：AglientExtend C18（250mm×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫，見表2。

表1藥材來(lái)源

表2梯度洗脫

檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。

流速：1.0mL/min。

柱溫：30℃。

進(jìn)樣量：10μL。

2.4流動(dòng)相考察：研究過(guò)程中，考察了不同濃度的乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液等不同體系的梯度洗脫系統(tǒng)。結(jié)果表明，以乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫分離效果最好，特征峰明顯。因此，本研究選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫，分析時(shí)間為60min。2.5檢測(cè)波長(zhǎng)考察：吸取上述供試品溶液適量，以色譜條件分析，利用DAD檢測(cè)品經(jīng)過(guò)190～400nm全波長(zhǎng)掃描，大多數(shù)成分在波長(zhǎng)280nm處有較大吸收，主要色譜峰分離較好，基線平穩(wěn)，故確定280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.6參照物考察及共有峰標(biāo)定：根據(jù)以上方法對(duì)16批黃芪藥材指紋圖譜進(jìn)行分析，結(jié)合相似度結(jié)果，標(biāo)定14個(gè)共有峰，以峰4（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）為參照峰，見圖1。

2.7測(cè)定方法：分別精密取對(duì)照品溶液和各樣品溶液10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜峰的保留時(shí)間及峰面積為t計(jì)算其他峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。

3方法學(xué)考察

3.1精密度試驗(yàn)：取同一批黃芪藥材（S9，產(chǎn)地山西渾源）供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察峰面積的精密度，結(jié)果表明儀器和系統(tǒng)的精密度良好，見表3。

表3精密度相似度試驗(yàn)結(jié)果

3.2穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批黃芪藥材（S9，產(chǎn)地山西渾源）供試品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24、36、48 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明48h內(nèi)穩(wěn)定，見表4。

表4穩(wěn)定性相似度試驗(yàn)結(jié)果

3.3重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批黃芪藥材（S9，產(chǎn)地山西渾源）6份，分別制備成供試品溶液，測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果表明重復(fù)性良好，見表5。

表5重復(fù)性相似度試驗(yàn)結(jié)果

4不同產(chǎn)地藥材考察結(jié)果分析

4.1相似度分析：指紋圖譜的相似度是指紋圖譜的整體相關(guān)性，它把指紋圖譜的重疊率和共有峰的峰強(qiáng)度結(jié)合起來(lái)。本部分根據(jù)上述方法對(duì)16批黃芪藥材指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，數(shù)據(jù)處理采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版（2004A）計(jì)算，結(jié)果見表6。

表6不同產(chǎn)地藥材相似度結(jié)果

結(jié)果顯示，16批黃芪藥材相似度差異較大，其中S3、S4、S5、S8、S9、S11、S12、S15和S16均大于0.9。

4.2相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積：取黃芪藥材16批，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，得出16批樣品的HPLC圖譜，見圖2，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，求出RSD值，其中14個(gè)共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值為34.675%～189.408%，總峰面積大于均值的有S9、S10、S12、S13、S15、S16，結(jié)果見表7、8。

表7 16批黃芪相對(duì)保留時(shí)間

表8 16批黃芪相對(duì)峰面積

結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地黃芪藥材樣品間相對(duì)保留時(shí)間差異較小，相對(duì)峰面積差異較大。因此，選擇相似度大于0.9的產(chǎn)地藥材，即S9、S11、S12、S13、S15和S16，產(chǎn)地分別為山西渾源、山西渾源、山西應(yīng)縣、陜西子洲、內(nèi)蒙古和對(duì)照藥材，作為日后研究與生產(chǎn)的備選藥材。

5討論

以單一的有效成分控制中藥質(zhì)量已不能適應(yīng)中藥現(xiàn)代化的形勢(shì)，中藥指紋圖譜可以在不清楚全體化學(xué)成分的情況下，有效控制中藥的內(nèi)在質(zhì)量，提高中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性［7］。本研究采用HPLC建立黃芪藥材總黃酮指紋圖譜分析方法，經(jīng)方法學(xué)考察和16批樣品的測(cè)定分析，結(jié)果顯示，該方法穩(wěn)定、可靠、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為篩選黃芪藥材及質(zhì)量控制參考，提高質(zhì)量控制水平。

本研究曾考察水、70%乙醇、70%甲醇等為提取溶劑提取黃芪藥材中總黃酮成分的工藝進(jìn)行薄層色譜鑒定的定性考察，結(jié)果顯示以水為提取溶劑的薄層色譜圖比以乙醇和甲醇為提取溶劑的薄層色譜圖在相同位置上的斑點(diǎn)少，而以乙醇和甲醇為提取溶劑的薄層色譜有相同的斑點(diǎn)數(shù)，相同斑點(diǎn)的位置一致，斑點(diǎn)大小和顏色一致，即以水為提取溶劑提取得到黃芪藥材的成分較少。故提取溶劑選擇乙醇或甲醇?？紤]環(huán)保、成本與安全性，最終選擇乙醇作為黃芪的提取溶劑。

本研究采用HPLC指紋圖譜應(yīng)用于黃芪藥材的鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)，能更有效評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量；通過(guò)使用中藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，為指紋圖譜研究成果運(yùn)用于中藥材生產(chǎn)和市場(chǎng)流通的質(zhì)量分析提供一個(gè)新方法，對(duì)科研和生產(chǎn)實(shí)踐具有重要指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.一部.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：302-303.

［2］張薔，高文遠(yuǎn)，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37（21）：3203-3207.

［3］Xu YH，Xiong J，Wang SS，Tang D，Wang RS，Zhu Q.Calycosin entered HUVECs and ameliorated AGEs-promoted cell apoptosis via the Bcl-2 pathway.J Nat Med.2014 Jan；68（1）：163-172.

［4］Xu Y，F(xiàn)eng L，Wang S，Zhu Q，Zheng Z，Xiang P，He B，Tang D.Calycosin protects HUVECs from advanced glycation end products-induced macrophage infiltration.J Ethnopharmacol.2011 Sep 1；137（1）：359-370.

［5］Xu Y，F(xiàn)eng L，Wang S，Zhu Q，Lin J，Lou C，Xiang P，He B，Zheng ZG，Tang D，Zuo G.Phytoestrogen Calycosis-7-O-β-D-Glucopyranoside Ameliorates Advanced Glycation End Products-Induced HUVEC Damage.Journal of Cellular Biochemistry. 2011 June；112：2953-2965.

［6］Tang D，He B，Zheng ZG，Wang RS，Gu F，Duan TT，Cheng HQ，Zhu Q.Inhibitory effects of two major isoflavonoids in Radix Astragali on high glucose-induced mesangial cells proliferation and AGEs-induced endothelial cells apoptosis.Planta Med.2011 May；77（7）：729-732.

［7］黃曉玲，朱荃，鄭兆廣，等.尿毒清顆粒HPLC指紋圖譜研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（6）：45-47.

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8351（2016）07-0008-03

*通訊作者

HPLC fingerprinting of Flavonoids in Radix astragali

Cheng Bocong1Wang Rushang2*Luo Dexiang1（1.Foshan Hospital of TCM，Guang Dong，F(xiàn)o Shan，528000；2.Guangzhou Consun Drug Research Ltd.，Guang Dong，Guang Zhou，510663）

Abstract：Objective：To study and to establish the HPLC fingerprint of Flavonoids in Radix astragali，and estimate the quality of Radix astragali in various species from different habitats.Methods：The method adopts DAD detector，AglientExtend C18（250mm×4.6mm，5μm）column，mobile phase was acetonitrile（A）-0.2%formic acid aqueous solution（B），with gradient elute.The flow rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was 280 nm.Results：We established 14 characteristic peaks of HPLC fingerprint，the results of method validation met technical standard of fingerprints.Conclusion：The method is stable and reliable with a good reproducibility and to be used to control its quality with combination assaying.

Key words:Radix astragali Flavonoids HPLC Fingerprints