楊云

（定西市人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000）

角質(zhì)細(xì)胞生長因子促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移研究

楊云

（定西市人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000）

目的 了解角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF）對(duì)人表皮細(xì)胞遷移的影響。方法 在試驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入KGF，于48、96、144 h后觀察表皮細(xì)胞的遷移距離，并與對(duì)照組比較。結(jié)果 KGF可有效促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移。144 h后，試驗(yàn)組細(xì)胞遷移的距離幾乎是對(duì)照組的2倍。結(jié)論 KGF是一種特異性較強(qiáng)、能夠促使上皮細(xì)胞遷移的生長因子，應(yīng)對(duì)其做進(jìn)一步研究。

角質(zhì)細(xì)胞生長因子；表皮細(xì)胞；損傷修復(fù)；劃痕試驗(yàn)

角質(zhì)細(xì)胞生長因子（Keratinocyte Growth Factor，KGF）是一種特異性的高效促上皮細(xì)胞增殖的生長因子，在損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[1，2]。KGF最初發(fā)現(xiàn)于人胚胎肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中[3]，雖然不是由上皮組織產(chǎn)生，但屬于FGF家族成員（也稱之為FGF-7）[4]。本試驗(yàn)利用劃痕創(chuàng)傷觀察KGF對(duì)人皮膚細(xì)胞的促遷移能力，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料收集與分離

取1例病人手術(shù)中切除的皮膚組織9塊，重復(fù)試驗(yàn)3次。經(jīng)PBS（磷酸緩沖鹽溶液）沖洗后置入Dispase酶中，4℃過夜；收集皮片，置0.25%胰酶與0.02%EDTA（1∶1）混合液中，37℃，10～15 min，經(jīng)吹打、過濾后收集單細(xì)胞懸液加入SKF上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，以10×104/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%時(shí)，用0.25%胰酶消化后接種傳代，取2~3代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)研究。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與觀測(cè)

在6孔板中接種表皮細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿后，制備80%μm寬的劃痕并標(biāo)記，作為細(xì)胞遷移的基點(diǎn)。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，試驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入15.0 ng/ml的KGF，對(duì)照組不添加。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于48、96、144 h觀察，取10個(gè)遷移最遠(yuǎn)的不同點(diǎn)測(cè)量距離，以平均值作為表皮細(xì)胞的遷移距離。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)結(jié)果以SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示有顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

原代培養(yǎng)皮膚表皮細(xì)胞，3~5 d可見細(xì)胞貼壁生長。細(xì)胞展開后為多角形，呈典型的鋪路石樣，具有明顯的上皮細(xì)胞培養(yǎng)特征（見圖1）。

圖1　體外培養(yǎng)的人表皮細(xì)胞

2.2劃痕試驗(yàn)結(jié)果

24 h后，細(xì)胞可見明顯遷移；48 h后試驗(yàn)組遷移距離較對(duì)照組遠(yuǎn)，試驗(yàn)組為（29.20±0.02）μm，對(duì)照組為（21.70±0.03）μm；96 h后試驗(yàn)組為（50.10±0.01）μm，對(duì)照組為（37.50±0.04）μm，有顯著性差異；144 h后試驗(yàn)組劃痕基本覆蓋，而對(duì)照組仍可見明顯的細(xì)胞空白區(qū)（見圖2、3）。

與對(duì)照組相比，KGF促表皮細(xì)胞遷移能力隨著時(shí)間的延長逐漸明顯。96 h后兩組間出現(xiàn)顯著性差異，144 h后試驗(yàn)組細(xì)胞遷移的距離幾乎是對(duì)照組的2倍。

圖2　KGF對(duì)人皮膚表皮遷移的影響

圖3　KGF促進(jìn)人皮膚表皮細(xì)胞遷移效應(yīng)

3結(jié)論

劃痕試驗(yàn)是體外試驗(yàn)中最常用的檢測(cè)創(chuàng)傷愈合的模型，其有效模擬了創(chuàng)傷愈合初期由細(xì)胞伸展、增殖、遷移覆蓋創(chuàng)面的過程[5]。本試驗(yàn)中，我們選擇此模型用以觀察KGF對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響。

Nguyen等[6]曾就KGF對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移作用進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)KGF可明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、增殖，并呈濃度依賴性。本次試驗(yàn)我們借鑒其他試驗(yàn)中所采用的KGF濃度來刺激人表皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KGF可有效促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移。作用144 h后，試驗(yàn)組細(xì)胞遷移距離幾乎是對(duì)照組的2倍，這與Marti等[7]在小鼠創(chuàng)傷模型中觀察到的結(jié)果一致。已有研究表明，KGF是一種特異性的高效促上皮細(xì)胞增殖的生長因子，可以促進(jìn)有絲分裂，這與c-myc、c-fos c以及核苷酸合成的調(diào)節(jié)酶的表達(dá)有關(guān)[8]。所以，試驗(yàn)組劃痕愈合時(shí)間明顯短于對(duì)照組，可能與KGF促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖能力有一定關(guān)系，但對(duì)于KGF如何促進(jìn)細(xì)胞遷移，目前還不明確，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)利用體外表皮創(chuàng)傷模型觀察KGF對(duì)人表皮細(xì)胞的促遷移能力，進(jìn)一步證實(shí)和肯定其在皮膚創(chuàng)傷愈合方面的巨大潛能，為臨床應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

[1]Braun S，Krampert M，Bodó E，et al.Keratinocyte growth factor protects epidermis and hair foll icles from cell death induced by UV irradiation，chemotherapeutic or cytotoxic agents[J].J Cell Sci，2006，119（23）：4841-4849.

[2]Belleudi F，Leone L，Aimati L，et al.Endocytic pathways and biological effects induced by UVB-dependent or l igand-dependent activation of the keratinocyte growth factor receptor[J].FASEB J，2006，20（2）：395-397.

[3]Rubin J S，Osada H，F(xiàn)inch P W，et al.Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1989（86）：802-806.

[4]Marchand-Adam S，Plantier L，Bernuau D，et al.Keratinocyte growth factor expression by fibroblasts in pulmonary fibrosis：poor response to interleukin-1beta[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2005，32（5）：470-477.

[5]Mathew A C，Rajah T T，Hurt G M，et al.Influence of antiestrogens on the migration of breast cancer cells using an in vitro wound model[J].Clin Exp Metastasis，1997（15）：393-399.

[6]Nguyen T N，Zang X P，Pento J T.Keratinocyte growth factor stimulates the migration and proliferation of breast cancer cells in a culture wounding model[J].Pharmacol Res，2002，46（2）：179-183.

[7]Marti G P，Mohebi P，Liu L，et al.KGF-1 for wound healing in animal models[J].Methods Mol Biol，2008（423）：383-391.

[8]宗憲磊，蔡景龍，姜篤銀，等.角質(zhì)細(xì)胞生長因子研究進(jìn)展[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2009，23（2）：188-193.

G424.31

B

1671-1246（2016）13-0098-03