陜西省人民醫(yī)院(西安 710068)

楊娣娣　韓秀蕊　胡淑玲　安　娜△　劉先寧△▲　魏緒倉(cāng)

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惡性血液病患者侵襲性真菌感染分子生物學(xué)診斷研究*

陜西省人民醫(yī)院(西安 710068)

楊娣娣韓秀蕊胡淑玲安娜△劉先寧△▲魏緒倉(cāng)

摘要目的: 了解惡性血液病患者發(fā)生侵襲性真菌感染(IFI)的菌種類別，為預(yù)防及臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。方法: 收集疑似IFI的惡性血液病人痰、血液等標(biāo)本,分離出真菌40株，采用半巢式基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法進(jìn)行鑒定，同時(shí)與培養(yǎng)后表型診斷結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果: 用基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法40株真菌均鑒別出菌種，鑒定率為100%；用培養(yǎng)后表型法37株鑒定出菌種，3株尚未鑒定出菌種，鑒定率為92.5%。結(jié)論:采用基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法可快速、準(zhǔn)確的鑒別出惡性血液患者IFI的菌種類別。

主題詞血液腫瘤/診斷細(xì)菌感染和真菌病分子生物學(xué)

近年來(lái)隨著免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物、糖皮質(zhì)激素及廣譜抗生素在臨床中的廣泛應(yīng)用，惡性血液病患者自身免疫力急劇下降，成為侵襲性真菌感染(Invasive fungal infections,IFI)的高危人群，病死率較高[ 1]。我們采用基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序方法對(duì)臨床考慮IFI的惡性血液病患者痰液、血液等標(biāo)本中分離的40株真菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果100%鑒別出菌種，同時(shí)與培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)比研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料和方法

1標(biāo)本來(lái)源收集2012年2月至2015年6月陜西省人民醫(yī)院及西安市第一醫(yī)院擬診為IFI的惡性血液病患者痰液、血液等標(biāo)本98例份，沙堡弱瓊脂平皿(SDA), 28°C(相對(duì)濕度46%)進(jìn)行培養(yǎng)，其中有40例獲得單個(gè)菌落。包括急性白血病26例，淋巴瘤8例，多發(fā)性骨髓瘤4例，噬血細(xì)胞綜合征2例。

2真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株白色假絲酵母菌(Candida albicans)、C54煙曲霉菌( Asperginius fumigatus)標(biāo)準(zhǔn)菌株,均購(gòu)于陜西省微生物研究所菌種保藏中心，使用前進(jìn)行傳代培養(yǎng)，形態(tài)學(xué)確認(rèn)。

3試劑與儀器真菌基因組DNA提取試劑盒，DNeasy Plant Mini Kit，購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；2×Taq plus PCR MasterMix購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；DNA Marker購(gòu)于大連TaKaRa生物工程有限公司；引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序，由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列,見表1。Mastercycler gradient PCR儀，購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；電泳儀和紫外分析儀，購(gòu)于北京六一儀器廠。假絲酵母樣菌顯色培養(yǎng)基( 鄭州安圖生物工程股份有限公司 )。

表1　真菌18SrRNA ITS2區(qū)引物序列

4研究方法

4.1培養(yǎng)后絲狀真菌的表形鑒定方法：將真菌菌株、菌落用無(wú)菌生理鹽水制成菌液，接種沙堡弱瓊脂平皿(SDA)28°C,培養(yǎng)7～10d。每日觀察并記錄菌落的形態(tài)、大小， 顏色，采用棉蘭染色顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態(tài)，根據(jù)以上生物學(xué)表型特征綜合分析進(jìn)行鑒別診斷。

4.2酵母樣真菌顯色培養(yǎng)表型鑒定方法：將菌種接種于沙堡弱瓊脂平皿(SDA),28°C，濕度46%，進(jìn)行培養(yǎng)，獲得單個(gè)菌落。挑取單個(gè)菌落，接種于顯色培養(yǎng)基平皿內(nèi)，置培養(yǎng)箱28°C，濕度46%培養(yǎng)，每天觀察一次結(jié)果，根據(jù)菌落顏色進(jìn)行菌種鑒定：菌落光滑奶油色到白色為光滑假絲酵母菌，紫紅色邊緣模糊有微毛為克柔假絲酵母菌，綠色、翠綠色為白色假絲酵母菌，灰藍(lán)色、鐵藍(lán)色為熱帶假絲酵母菌。

4.3基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序分析鑒定方法[ 2-5]

4.3.1真菌DNA的提取：依次取標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)本真菌單個(gè)菌落約5 mg置于5 ml離心管中, 采用加液氮研磨成為粉狀, 再按照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說(shuō)明書中的提取步驟進(jìn)行，提取真菌基因組DNA，最終獲得到(10～50)ng/μl的DNA溶液。

4.3.2進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增真菌ITS2區(qū)：PCR引物采用通用引物序列,見表1。第一輪PCR擴(kuò)增：總體積為20 μl，其中模板為提取的真菌DNA 2 μl，引物ITS1，ITS4各1 μl，2×premix Tag 10 μl，無(wú)菌去離子水6 μl；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min后, 95 ℃ 30 s ，55 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min共計(jì)35個(gè)循環(huán)， 72 ℃延伸6 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。第二輪PCR擴(kuò)增：總體積50 μl，其中模板為第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物2 μl，引物ITS86，ITS4各1 μl，2×premix Tag 25 μl，無(wú)菌去離子水21 μl；反應(yīng)程序95 ℃預(yù)變性5 min后, 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s ，72 ℃ 30 s共計(jì)35個(gè)循環(huán)， 72 ℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)反應(yīng)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

4.3.3序列比對(duì)與種屬分析：測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物信息中心( NCBI)的BLAST工具與基因庫(kù)中真菌核酸序列比對(duì)，確定其種屬。

結(jié)果

1標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)煙曲霉菌、白色念珠菌菌株經(jīng)培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)確認(rèn)采用基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法進(jìn)行鑒定，其結(jié)果與NCBI基因庫(kù)中的真菌核酸序列比對(duì)，結(jié)果完全一致。

2真菌株鑒定結(jié)果從患者痰液、血液等標(biāo)本中分離的40株真菌，采用基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法鑒定，均鑒別到種，比率為40/40(100%),見表2。采用培養(yǎng)后表型法鑒定，37株鑒定到種，且與基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法鑒定結(jié)果一致。有3株未能鑒定出菌種，比率為37/40(92.5%)。

表2　40株真菌采用基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法鑒定出菌種類別及構(gòu)成比

討論

惡血性血液病患者繼發(fā)真菌感染后，因缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，加之既往表型診斷方法的缺陷，如培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，特異性差，以及長(zhǎng)期用藥等因素的影響，致使真菌形態(tài)變異難以鑒別其種屬。導(dǎo)致病人延遲診治，甚至感染致死。資料顯示，惡性血液病合并IFI致死率高達(dá)60%[6]。IFI的發(fā)病率一直持續(xù)上升，特別是侵襲性曲霉菌感染(Invasive aspergilius,IA)病死率很高，對(duì)免疫力低下的惡性血液病患者來(lái)說(shuō)，及時(shí)的診斷和治療是提高患者生存質(zhì)量和改善預(yù)后的關(guān)鍵。G試驗(yàn)(1,3-β-D葡聚糖檢測(cè))、GM試驗(yàn)(半乳甘露聚糖檢測(cè))的廣泛開展給IFI、IA的搶先治療提供了依據(jù)，但由于不能確定到菌種，臨床為了避免復(fù)發(fā)，達(dá)到治愈的目的，常采取聯(lián)合用藥、療程較長(zhǎng)，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我們采用半巢式基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法可以鑒定到菌種，使臨床治療更具有針對(duì)性，減少患者費(fèi)用。

本研究采用基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法對(duì)惡性血液病患者痰及血液等標(biāo)本中分離的40株真菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果鑒定率100%。分析鑒定結(jié)果顯示，曲霉菌居首位占50%，其次為酵母樣菌占45%。在曲霉菌中，以煙曲霉菌為主占75%，黃曲霉菌占20%，土曲霉菌占5%。在酵母樣菌中，白色假絲酵母菌據(jù)首位占50%。其次為光滑假絲酵母菌占28%，熱帶假絲酵母菌占11%，克柔假絲酵母菌占5.5%。以上鑒定結(jié)果和培養(yǎng)后表型鑒定結(jié)果相一致。另外采用該法還鑒定出挪威假絲酵母菌1株，綠色木霉菌一株，婁地青霉菌一株，而采

用培養(yǎng)法這幾株菌均未鑒定出菌種。

隨著惡性血液病治療技術(shù)的不斷進(jìn)步,此類病人真菌感染的防治尤顯重要。其關(guān)鍵是要做到早診斷、早治療?；驍U(kuò)增聯(lián)合測(cè)序技術(shù)，是在聚合酶鏈反應(yīng)基礎(chǔ)之上，采用18SrRNA基因保守區(qū)ITS2區(qū)的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，而半巢式PCR擴(kuò)增又極大地提高PCR反應(yīng)的靈敏度，是一種特異性，靈敏度極高的早期實(shí)驗(yàn)室診斷方法，能早期發(fā)現(xiàn)微量樣本中的病原體，彌補(bǔ)培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率較低的不足；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的海量序列加以比對(duì)，從而鑒別診斷出真菌的種屬，該方法能鑒別出絕大多數(shù)真菌種屬，不受表型變異的影響。

我們認(rèn)為PCR基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法可快速、準(zhǔn)確的鑒別出惡性血液病IFI的菌種類別，對(duì)IFI患者的早期診斷及治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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(收稿:2015-10-12)

通訊作者▲

【中圖分類號(hào)】R392.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.07

Molecular biological diagnosis of invasive fungal infection in patients with malignant hematologic diseases

Shaanxi Provincial People's Hospital(Xi’an 710068)

Yang DidiHan XiuruiHu Shulinget al

ABSTRACTObjective:To understand the species of invasive fungal infection in patients with malignant hematological diseases, to provide scientific evidence for the prevention and treatment. Methods: The 40 strains of fungi isolated from the body fluid samples such as sputum, blood were identified by gene amplification and sequencing and then compared with the diagnosis from culture method. Results:The 40 strains of fungi were identified by gene amplification and sequencing, the rate of identification was 100%; 37 strains were identified by culture method, 3 strains couldn’t be identified, the rate of identification was 92.5%. Conclusion:The species of invasive fungal infection in patients with malignant hematological diseases can be identified quickly and accurately by gene amplification and sequencing method.

KEY WORDSHematologic neoplasms/diagnosisBacterial infections and mycosesMolecular biology

*陜西省社發(fā)攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(2011K12-23)

西安市科技局項(xiàng)目[SF 09023(3)]

△西安市第一醫(yī)院，陜西省眼科研究所