劉道泉，吳波平（. 福州市動物疾病預(yù)防控制中心，福建福州　350003；. 福建省動物疾病預(yù)防控制中心，福建福州　350003）

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一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒野毒株的基因序列分析

劉道泉1，吳波平2
（1. 福州市動物疾病預(yù)防控制中心，福建福州350003；2. 福建省動物疾病預(yù)防控制中心，福建福州350003）

摘要：為了解福建省福州市的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的分子流行病學情況，對從一例豬繁殖與呼吸綜合征臨床疑似病例中分離的PRRSV，特異性擴增了其ORF3、ORF5、NSP2片段，然后進行基因測序和分析。結(jié)果表明：該毒株NSP2編碼區(qū)、ORF3基因、ORF5基因與國內(nèi)流行的PRRSV變異株核苷酸同源性分別在94.9%~97.7%、95.2%~97.7%和96.1%~96.7%。由此推斷，該株由國內(nèi)流行的變異毒株演化而來。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；基因序列分析；進化樹

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種危害當前養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒之一，可引起母豬繁殖障礙，斷奶仔豬發(fā)生肺炎、生長遲緩以及高死亡率[1-3]。感染豬只通過唾液、鼻分泌物、尿液、精液以及糞便排毒[4]；懷孕后期感染母豬可通過乳汁排毒；公豬精液帶毒期可達90 d。PRRSV具有高度宿主依賴性，主要在豬肺泡巨噬細胞以及其他組織巨噬細胞中生長，也能在睪丸細胞中生長[5-6]。由于PRRSV是一種小RNA病毒，其基因組易于變異且不同毒株僅有部分具有交叉保護作用，因此基因測序成為PRRSV的常規(guī)診斷方法，同時對疫苗毒株的選擇有重要意義[7]。NSP2除了在病毒的復(fù)制中發(fā)揮作用外，其含有大量抗原決定簇，可以被感染宿主的免疫系統(tǒng)識別[8]。

研究表明，全球大多數(shù)生豬養(yǎng)殖國家中普遍存在PRRSV重組株，其可產(chǎn)生嵌合病毒株[9-10]。境外新毒株的傳入已造成不少豬場感染和發(fā)病，成為近年來的流行毒株之一，NADC30-like毒株已在我國多個地區(qū)流行和傳播[11]。當前由于盲目使用、長時間使用、高頻度免疫而導(dǎo)致豬場出現(xiàn)臨床發(fā)病、豬群不穩(wěn)定的現(xiàn)象十分普遍，許多豬場的 藍耳病已由疫苗毒所致，而非野毒感染[11-13]。

當前由于豬場生物安全難以做到位，以及高致病性減毒活疫苗的誤用和不正確使用，使得豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株的多樣性急劇攀升、變異程度加快，出現(xiàn)了不少新的毒株、重組毒株。其與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒野毒株在豬場共存，難以區(qū)分是野毒感染還是疫苗毒感染[11，14-15]。為此，進行分離株的基因測序分析是非常有必要的，這不僅為進一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒的生物學信息奠定基礎(chǔ)，也為探索有效的防控方案奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1病料

病料來源于福州市某規(guī)?；i場免疫過豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）疫苗（經(jīng)典株）的50~60日齡保育豬。臨床表現(xiàn)為體溫升高至41℃左右，腹式呼吸，部分出現(xiàn)腹瀉癥狀；剖檢可見肺間質(zhì)增寬、淤血，脾臟腫大梗死，淋巴結(jié)腫大出血等。選擇臨床癥狀典型的病豬，采集扁桃體、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、血液等樣品。

1.2主要試劑

Premix Ex Taq（TaKaRa Ex Taq Version 2.0 plus dye）、Primer Script One Step RT-PCR Kit ver.2、6 Loading buffer、分子量標準DL2000 Marker、克隆載體pMD-18T Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司；Hight Pure Viral RNA Kit，購自Roche；PRRSV熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自北京生科尚儀；瓊脂糖（Agarose）、感受態(tài)細胞DH5α大腸桿菌（Escherichia coli），購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Goldview染料，購自賽百盛；膠回收（小量）試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，以及常規(guī)化學試劑、耗材和藥品，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3病毒核酸的提取

采集患病豬只的肺部組織、肺門淋巴結(jié)，充分剪碎后置于2 mL離心管中，加入800 μL高鹽溶液；用漩渦振蕩器充分震蕩混勻后，反復(fù)凍融3次，離心3 000 rpm 2 min，取上清。按照動物組織基因組RNA提取試劑盒（Hight Pure Viral RNA Kit）操作方法提取組織RNA，洗脫核酸，后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計

參考楊漢春等[8-9]文獻，設(shè)計引物并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5病毒的檢測、克隆、測序和序列分析

PRRSV的檢測按照北京生科尚儀的方法進行。確診為PRRSV陽性后，對ORF3、ORF5、ORF7、NSP2片段進行克隆，PCR擴增體系為25 μL，其中Primer Script 1 Step Enyzyme Mix 1 μL、2 1 Step Buffer 12.5 μL、上下游引物（20 μm/mL）各1 μL、DNA模板9.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒Gel Extraction Kit切膠回收后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。隨機選擇8個克隆，用質(zhì)粒提取試劑盒UNIQ-10提取質(zhì)粒，用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒。隨機選擇3份陽性重組質(zhì)粒送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。用DNAStart軟件，將測序結(jié)果與GenBank中收錄的國內(nèi)外參考毒株進行比較分析，繪制遺傳進化樹。

2　結(jié)果

2.1目的基因擴增結(jié)果

應(yīng)用特異性引物，擴增出PRRSV ORF3、ORF5、ORF7、NSP2基因片段，大小與預(yù)期相符，結(jié)果見圖1。

2.2基因序列的拼接與同源性比較

圖1　 目的片段1%瓊脂糖凝膠電泳

將該毒株（MX-2015）序列測序結(jié)果，經(jīng)BLAST分析驗證后，和GenBank中登錄的PRRSV代表株進行核苷酸同源性比較。其ORF3基因核苷酸序列長度為765 bp，編碼255個氨基酸；其核苷酸與其他毒株比對，發(fā)生點狀變異，與國內(nèi)其他PRRSV變異株核苷酸同源性為97.1%~97.8%，與國外毒株同源性為62.7%~91.9%，與國內(nèi)最新分離毒株NADC-30同源性僅為84.1%（圖2~3）。

圖2　PRRSV ORF3核苷酸序列比對

圖3　PRRSV ORF3核苷酸同源性比較

圖4　PRRSV ORF5核苷酸序列比對

圖5　PRRSV ORF5核苷酸同源性比較

其ORF5核苷酸序列長度為603 bp，編碼201個氨基酸，核苷酸序列在第87~150位發(fā)生明顯點狀突變，與國內(nèi)其他PRRSV變異株核苷酸同源性為97.2%~97.7%，與JXA1同源性最高，為97.7%，同國內(nèi)經(jīng)典株CH-1a株同源性為87.7%，同國外分離株同源性為63.3%~90.7%，與國內(nèi)最新分離毒株核苷酸同源性為85.4%（圖4~5）。

其NSP2核苷酸序列長度為2 827 bp，與其他流行毒株的核苷酸比對，在第570~640位發(fā)生明顯點狀突變，與國內(nèi)其他PRRSV變異株核苷酸同源性為96.1%~96.7%，同國內(nèi)經(jīng)典株CH-1a株同源性為89.9%，同國外分離株同源性為52%~86.5%（圖6~7）。

3　討論

PRRSV是世界范圍內(nèi)影響生豬生產(chǎn)的最重要病毒之一，可產(chǎn)生嚴重的經(jīng)濟損失和公共衛(wèi)生問題[16]。關(guān)于PRRSV的一個關(guān)鍵問題源于其基因多樣性，其被認為可直接影響免疫生物學、流行病學、診斷和疫苗效果。造成這種基因多樣性的一個重要原因是不同病毒株之間的重組[17-19]。一直以來，PRRSV NSP2、GP5和GP3的變異特征為該毒株分子衍化分析的重要指標[20]，故本研究對一株P(guān)RRSV毒株與毒株（MX-2015）的NSP2、ORF5、ORF3進行序列分析。結(jié)果表明，該毒株NSP2編碼區(qū)、ORF3基因、ORF5基因與我國主要的PRRSV變異株核苷酸同源性分別在94.9%~97.7%、95.2%~97.7%、96.1%~96.7%， 與國外分離株的核苷酸同源性分別為 62.7%~91.9%、63.3%~90.7%、52%~86.5%。

圖6　 PRRSV NSP2核苷酸序列比對

圖7　 PRRSV NSP2核苷酸同源性比較

通過遺傳進化樹的分析比對， MX-2015株與國內(nèi)PRRSV變異株JX株、TJ株、HUN株、GD株等均處于同一分支，推斷該毒株仍是由這些毒株變異演化而來。本試驗結(jié)果豐富了福建省PRRSV的基因組數(shù)據(jù)。

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（責任編輯：朱迪國）

Genetic Analysis on One Wild Strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Liu Daoquan1，Wu Boping2
（1.Fuzhou Animal Disease Control Center，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350003；2. Fujian Provincial Animal Disease Control Center，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350003）

Abstract：In order to understand the molecular epidemiological situation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in Fuzhou city of Fujian province，one virus strain from suspected cases of PRRS was isolated and the ORF3，ORF5 and NSP2 were sequenced. The data showed that the NSP2，ORF3 and ORF5 of this strain shared the nucleotide identity with 94.9%~97.7%，95.2%~97.7% and 96.1%~96.7% respectively，compared with main PRRSV strains in China. Therefore， it was inferred that this strain was evolved from popular variant strains in China.

Key words：PRSSV；genetic analysis；phylogenetic tree

中圖分類號：S851.3

文獻標識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）07-0086-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.026

基金項目：福建省農(nóng)業(yè)科學技術(shù)項目（2014-01）

通訊作者：吳波平