時(shí)建立、彭　喆、王莉莉、徐勝男、張玲玲、鄭書(shū)軒、朱曉琳、吳曉燕、徐紹建、王金寶、李 ?。?1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南　250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南　250100；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島　266109）

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豬流行性腹瀉病毒LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

時(shí)建立1，2、彭喆1，2、王莉莉1，2、徐勝男1，2、張玲玲2，3、鄭書(shū)軒2，3、朱曉琳1，2、吳曉燕1，2、徐紹建1，2、王金寶1，2、李 俊1，2
（ 1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

摘要：豬流行性腹瀉病毒是引起仔豬腹瀉死亡的主要病原。為實(shí)現(xiàn)對(duì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的快速檢測(cè)，利用PEDV S基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化各種反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)PEDV的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法（LAMP）。此方法特異性好，敏感度強(qiáng)，將反轉(zhuǎn)錄后的病毒cDNA稀釋到108倍仍可檢出，是PCR方法的100倍。本研究建立的LAMP方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，為臨床PEDV的快速檢測(cè)和預(yù)防奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；快速診斷

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起豬水樣腹瀉、嘔吐和高度脫水為特征的，并能夠通過(guò)接觸傳播的腸道傳染病的主要致病原，可危害各年齡豬群，其中以哺乳仔豬尤為嚴(yán)重，病死率80%以上。自 1978 年在比利時(shí)首先報(bào)道分離到 PEDV以來(lái)[1]，豬流性腹瀉疫情（PED）在世界各地養(yǎng)豬業(yè)中都有暴發(fā)流行。特別是從 2010年末開(kāi)始，PED暴發(fā)更頻繁，造成仔豬嚴(yán)重腹瀉和大批死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。

快速診斷是控制PEDV的前提條件之一。針對(duì)PEDV，傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有病毒分離與鑒定、免疫熒光法、普通RT-PCR 技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等[4]。此類方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、所需試劑繁多、經(jīng)濟(jì)成本高，并且有設(shè)備和技術(shù)要求，難以在基層推廣普及。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)（LAMP）技術(shù)是2000年由Notomi等建立的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)可在等溫條件下通過(guò)特異DNA聚合酶作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定核苷酸序列的擴(kuò)增，具有特異性高、靈敏性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速、成本低廉和結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，目前在一些病原微生物的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用[5-7]。本試驗(yàn)針對(duì)PEDV S基因，建立了LAMP快速檢測(cè)方法，為臨床PEDV的快速診斷以及控制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）等，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存和提供。檢測(cè)用疑似病料采自濟(jì)南市周邊發(fā)病豬場(chǎng)。Bst DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL-2000購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1RNA模板的制備。取反復(fù)凍融3次后的PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液250 μL，采用RNA Trizol法提取病毒RNA，用隨機(jī)引物將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)Genbank公布的PEDV S基因序列，利用網(wǎng)站http://primerexplorer. jp/e/設(shè)計(jì)LAMP特異引物，包括外引物對(duì)（F3、B3）和內(nèi)引物對(duì)（FIP、BIP）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化。LAMP基本反應(yīng)體系為25 μL，成分包括：內(nèi)外引物、dNTPs、Betaine、Bst DNA 聚合酶、10 ThermoPol buffer、cDNA模板。反應(yīng)溫度在60~65 ℃，擴(kuò)增60 min左右，80 ℃ 10 min終止反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結(jié)果。也可在反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入1 uL SYBR GeenⅠ核酸染料，肉眼觀察溶液顏色變化或在紫外下觀察有無(wú)熒光。以基本反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，為確定最佳擴(kuò)增條件，選擇對(duì)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)影響較大的幾種因素進(jìn)行調(diào)整，如反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、Betaine濃度、Mg2+和dNTPs濃度，對(duì)各組分進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4LAMP方法靈敏度檢測(cè)。取反轉(zhuǎn)錄后的病毒cDNA，以生理鹽水10倍倍比稀釋，分別作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，同時(shí)與農(nóng)業(yè)部現(xiàn)行豬流行性腹瀉診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 544-2015）中的RTPCR方法進(jìn)行比較，確定LAMP反應(yīng)的靈敏度。

1.2.5LAMP方法特異性檢測(cè)。分別對(duì)PRRSV、CSFV、PPV、PCV2、PRV、TGEV和PEDV等進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)LAMP引物的特異性。反應(yīng)結(jié)束后在反應(yīng)管中加入1 uL SYBR GeenⅠ核酸染料，在紫外線下觀察陽(yáng)性反應(yīng)的特異性熒光。

1.2.6LAMP方法臨床樣品檢測(cè)。對(duì)從濟(jì)南市周邊疑似發(fā)病豬場(chǎng)采集的病料提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行LAMP檢測(cè)。同時(shí)采用PCR方法檢測(cè)，進(jìn)行陽(yáng)性率比較。

2　結(jié)果與分析

2.1LAMP條件的優(yōu)化

PEDV LAMP擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果在凝膠電泳中呈梯狀條帶，無(wú)模板的陰性對(duì)照擴(kuò)增無(wú)條帶。優(yōu)化結(jié)果顯示：最佳反應(yīng)溫度為61 ℃（圖1-A），dNTPs濃度在0.35 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最亮（圖1-B），Mg2+濃度在2.8 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最亮（圖1-C），betaine濃度在0.8 mol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最亮（圖1-D）。擴(kuò)增45 min即出現(xiàn)穩(wěn)定梯狀條帶，而擴(kuò)增60 min出現(xiàn)最亮條帶（圖1-E）。

最終優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系為1 μL cDNA模 板，4.0 μL FIP和 BIP引 物，0.5 μLF3和B3 引 物，3.5 μL dNTPs（10 μM），2.5 μL 10 ThermoPol buffer，1 μL Bst DNA polymerase，4 μL Betaine，0.7 μL Mgso4，加入超純水至25 μL。各反應(yīng)物在61 ℃水浴60 min，然后80 ℃ 5 min滅活終止反應(yīng)。

圖1　優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2LAMP反應(yīng)的靈敏度

將PEDV cDNA倍比稀釋進(jìn)行LAMP 反應(yīng)，結(jié)果cDNA稀釋到108倍仍可檢出（圖2-A）。將各稀釋的PEDV cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示PCR法的檢出限為DNA稀釋到106倍（圖2-B）。

由上圖可知：LAMP檢測(cè)方法的最低檢測(cè)量為108，常規(guī)PCR檢測(cè)方法的最低檢測(cè)量為106。LAMP方法的靈敏度是PCR方法的100倍。

2.3LAMP特異性檢測(cè)

對(duì)7種病毒分別采用蛋白酶K法提取DNA或者Trizol法提取病毒RNA，用隨機(jī)引物將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示僅PEDV cDNA出現(xiàn)特征性階梯狀擴(kuò)增條帶；反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入1 uL SYBR GeenⅠ核酸染料，在紫外線下觀察，也只有此管出現(xiàn)特異性熒光（圖3）。

2.4臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)從濟(jì)南市周邊疑似發(fā)病豬場(chǎng)共采集病料40份，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行LAMP檢測(cè)。同時(shí)采用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，兩者進(jìn)行陽(yáng)性率比較。

檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用PCR方法共檢測(cè)到10份陽(yáng)性病料，陽(yáng)性率為25%，采用LAMP方法共檢測(cè)到20份陽(yáng)性病料，陽(yáng)性率為50%，同時(shí)采用PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品在LAMP檢測(cè)時(shí)都為陽(yáng)性。（部分樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4）。

3　討論

PEDV是由I型冠狀病毒引起的，以豬腹瀉、嘔吐和脫水等為主要特征的病毒性腸道傳染病，對(duì)仔豬危害尤其嚴(yán)重，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。由于CV777弱毒苗或滅活苗的廣泛使用，2010年以前，PED在豬場(chǎng)基本處于可防控狀態(tài)。之后由于毒株變異或者環(huán)境的改變，PED在世界范圍內(nèi)廣泛暴發(fā)流行，甚至包括免疫過(guò)的豬場(chǎng)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[2，8-9]。

傳統(tǒng)方法檢測(cè)PEDV不僅操作繁瑣，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，且有設(shè)備和技術(shù)要求，難以在基層推廣普及。本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP檢測(cè)方法只需在61 ℃條件下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增60 min后，再在80 ℃條件下加熱5 min讓酶失活即可，并且LAMP 的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)凝膠電泳或者加入熒光染料的方法觀察結(jié)果。與湯小真等[10]建立的方法不同，此方法沒(méi)有在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加染料，避免了對(duì)檢測(cè)靈敏性和特異性的影響。該技術(shù)在等溫條件下即可進(jìn)行核酸變性和擴(kuò)增，不需要特殊的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中就可完成擴(kuò)增反應(yīng)，適合在基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)等一線單位推廣應(yīng)用。該方法方便快捷、成本低廉、特異性強(qiáng)，靈敏度是PCR檢測(cè)方法的100倍，對(duì)PED的有效防控具有重要意義，在PEDV的快速檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。

圖2　LAMP反應(yīng)靈敏度檢測(cè)結(jié)果

圖3　LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果

圖4　部分臨床樣品LAMP檢測(cè)（A）和PCR檢測(cè)（B）結(jié)果

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Establishment and Preliminary Application of LAMP for Porcine Epidemic Diarrhea Virus Detection

Shi Jianli1，2，Peng Zhe1，2，Wang Lili1，2，Xu Shengnan1，2，Zhang Lingling2，3，Zheng Shuxuan2，3，Zhu Xiaolin1，2，Wu Xiaoyan1，2，Xu Shaojian1，2，Wang Jinbao1，2，Li Jun1，2
（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100 ；2.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding，Jinan，Shandong 250100 ；3.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

Abstract：Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）is a major etiological factor of diarrhea and death in piglets. Loopmediated isothermal amplification（LAMP）assay for rapid detection of PEDV was developed and it could complete detection within 60 min. Both agarose gel electrophoresis and naked eyes were able to detect the products in the LAMP assay. The sensitivity of LAMP could reach to 108dilutions. These results indicated that the new LAMP method was a very simple and efficient detection method with high sensitivity and specificity for the clinical diagnosis of PEDV in swine farms，which would suit the requirements of rapid detection in laboratory and general conditions.

Key words：PEDV；LAMP；rapid detection

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）07-0082-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.025

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疫病控制崗位（SDAIT-06-021-07）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題

通訊作者：李俊