張　娜，王津津，謝艷輝，于　力，李家僑，劉　瑩（. 湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江　54000；. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳　58045）

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進(jìn)口南美白對(duì)蝦親蝦急性肝胰腺壞死病的檢測(cè)分析

張娜1，王津津2，謝艷輝1，于力2，李家僑1，劉瑩2
（1. 湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江524000；2. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045）

摘要 ：急性肝胰腺壞死病（AHPND）是一種新發(fā)疫病，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)損失巨大。其病原是攜帶毒素質(zhì)?；虻母比苎【?，但具體致病機(jī)制仍不清楚。本研究利用國(guó)外報(bào)道的毒素質(zhì)?；蛱禺愋砸铮瑢?duì)一批進(jìn)境南美白對(duì)蝦親蝦進(jìn)行了AHPND檢測(cè)。因其PCR的擴(kuò)增結(jié)果與國(guó)外所報(bào)道的基因片段一致，初步認(rèn)定為AHPND陽性。本文對(duì)此次檢測(cè)的結(jié)果和過程進(jìn)行了分析，為我國(guó)AHPND的檢測(cè)提供了分析數(shù)據(jù)。

關(guān)健詞：急性肝胰腺壞死；早期死亡綜合癥；毒素質(zhì)粒；PCR擴(kuò)增

2009年我國(guó)首次暴發(fā)急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）[1]，最初被稱為早死綜合癥（EMS）。近幾年來，很多國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)AHPND病原做了很多研究[2-8]。目前的研究資料表明，AHPND病原是一種特異的常見革蘭氏陰性菌——嗜鹽的副溶血性弧菌。其主要致病原因是由于副溶血性弧菌攜帶了PVA-1毒素質(zhì)粒。到目前為止，其致病機(jī)制仍不清楚。鑒于該病的危害巨大，目前世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列入水生動(dòng)物疫病法定報(bào)告名錄。

本研究利用針對(duì)毒素質(zhì)粒基因的引物，對(duì)一批進(jìn)境南美白對(duì)蝦親蝦進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)親蝦致病性AHPND菌株感染陽性。此次檢測(cè)為我國(guó)AHPND檢測(cè)方法的建立和監(jiān)控工作提供了重要資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。隨機(jī)采集廣東省湛江地區(qū)對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)親蝦3尾。rTaq 反應(yīng)酶、dNTP、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物 DL2000、瓊脂糖，均為大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2主要儀器設(shè)備。PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI 公司）、凝膠成像儀（德國(guó)Biometra公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf centrifuge 5417R）、電泳儀（DYY-8C，北京市六一儀器廠）。

1.2方法

1.2.1樣品處理。對(duì)進(jìn)境南美白對(duì)蝦親蝦活體3尾，取肝胰腺，按1∶10的比例放入1.5% NaCl的TSB培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/m，振蕩培養(yǎng)5~6 h。震蕩結(jié)束后，取菌液放入1.5 mL離心管中，3 000 r/m，離心5 min，棄上清，加PBS懸浮，按照核酸抽提試劑盒的操作提取DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增初篩。使用質(zhì)粒引物AP3：F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'；R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'。反應(yīng)體系為：10 PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水補(bǔ)至25 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃5 min，然后進(jìn)行32次循環(huán)（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃ 5 min，4 ℃ 保溫。

1.2.3nested-PCR擴(kuò)增。質(zhì)粒AP4-1引物：F1：5'-ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC-3'；R1：5'-ACG ATT TCG ACG TTC CCC AA-3'。 質(zhì)粒AP4-2引物：F2：5'-TTG AGA ATA CGG GAC GTG GG-3'；R2：5'-GTT AGT CAT GTG AGC ACC TTC-3'。反應(yīng)體系為：10 PCR buffer（Mg2+Plus） 2.5 μL，AP4-1上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水補(bǔ)至25 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 2 min；然后進(jìn)行30次循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90s），72 ℃ 2 min；4 ℃ 保溫。取第一步的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行第二步nested-PCR。反應(yīng)體系為：10 PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP4-2上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，第一步PCR產(chǎn)物2 μL，加水補(bǔ)至25 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 2 min；然后進(jìn)行25次循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），72℃ 2min；4 ℃ 保溫。

1.2.4質(zhì)粒毒素基因PCR擴(kuò)增。Pir VP A引物：F：5'- ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT G-3'；R：5'- TTA GTG GTA ATA GAT TGT ACA G-3'。Pir VP B引物：F：5'- GAG CCA GAT ATT GAA AAC ATT TGG-3'；R：5'- CCA CGC AGC GAG TTC TGT AAT GTA-3'。VpPirA-284引物：F：5'- TGA CTA TTC TCA CGA TTG GAC TG-3'；R：5'- CAC GAC TAG CGC CAT TGT TA-3'。VpPirB-392 引物：F：5'-TGA TGA AGT GAT GGG TGC TC-3'；R：5'- TGT AAG CGC CGT TTA ACT CA-3'。每個(gè)引物的擴(kuò)增反應(yīng)體系分別為：10 PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，各引物的上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水補(bǔ)至25 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 5 min；然后進(jìn)行30次循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s），72 ℃ 2 min；4 ℃ 保溫。

1.2.5擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與序列同源性比對(duì)。PCR擴(kuò)增條帶經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別與NCBI基因序列庫進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6不同保存條件下的組織和菌液PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)比對(duì)。肝胰腺組織、肝胰腺增菌液和PBS菌液懸浮液分別在-20 ℃、4 ℃和25 ℃條件下保存3天。同時(shí)對(duì)保存在25 ℃條件下的增菌液用TSB反復(fù)增菌5次，分別同時(shí)用AP3特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作如1.2.3。

1.2.7致病性副溶血弧菌的分離培養(yǎng)。在進(jìn)行1.2.1樣品處理的同時(shí)，取肝胰腺組織在TSA、TCBS和弧菌特異性顯色培養(yǎng)基中劃板，37 ℃，培養(yǎng)20~24 h，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，再PCR擴(kuò)增。在進(jìn)行1.2.1獲得肝胰腺組織增菌液之后，取增菌液劃板培養(yǎng)。

2　結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增初篩結(jié)果

以南美白對(duì)蝦親蝦肝胰腺增菌液的DNA為模板，進(jìn)行AP3引物擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示一條大小約為333 bp的特異性目的條帶，與預(yù)計(jì)的大小一致（圖1）。

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）、百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以“ ±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　 AP3引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2nested-PCR擴(kuò)增

以AP4引物進(jìn)行nest-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，第一步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 269 bp，第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物230 bp，與預(yù)計(jì)的大小一致（圖2）。

圖2　 AP4引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳分析

2.3質(zhì)粒毒素基因PCR擴(kuò)增

分 別 用PirVPA、PirVPB、VpPirA-284、Vp-PirB-392 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果與預(yù)計(jì)的大小一致（圖3）。

2.4擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與序列同源性比對(duì)

PCR擴(kuò)增條帶經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別與NCBI中基因序列比對(duì)。本文擴(kuò)增的陽性所有片斷都與Lee 等[9]所得到的序列有99.9%的同源性，結(jié)果一致。

2.5致病性副溶血弧菌的分離培養(yǎng)

圖3　 質(zhì)粒毒素引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳分析

同樣，用肝胰腺的增菌液劃板培養(yǎng)后，隨即挑取30個(gè)TCBS上特異性綠色菌落和顯色培養(yǎng)基中呈弧菌特征的粉色菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果為陰性。

檢測(cè)結(jié)果表明，所挑取的這些單菌落都沒有攜帶特異性致病基因，不是致病性副溶血弧菌菌株。

3　討論

2013年，Tran等[4]提出AHPND病原是一種特異的常見革蘭氏陰性菌株——嗜鹽性副溶血弧菌。通過一些未知的致病機(jī)制，這一菌株成為致病性菌株，從而誘導(dǎo)感染對(duì)蝦出現(xiàn)AHPND的特征性癥狀。Lightner[10]指出所有致病的副溶性弧菌中都包含一種-89序列基因，這可能是引發(fā)病害的關(guān)鍵序列。因?yàn)樗軌蚋淖僁NA序列基因的位置，引發(fā)基因突變，從而誘發(fā)病變。

有研究表明，即使AHPND引起HP細(xì)胞大量脫落而進(jìn)入HP管中，但是在病變位置沒有發(fā)現(xiàn)任何細(xì)菌[11]。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)一些觀點(diǎn)，即Tran等提出的AHPND獨(dú)特的病理學(xué)特征是由分泌毒素引起，即可肉眼觀察到的壞死病變是由一些未知毒素引起的，從而推測(cè)AHPND特異性癥狀由PIRAVP 和PIRBVP兩個(gè)分泌型毒素引起，并且這兩種蛋白都是由質(zhì)粒PVA1編碼的[2，11-12]。

Lee 等[9]進(jìn)而對(duì)2株AHPND致病菌株純化的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序（3HP和M1-1），測(cè)序結(jié)果顯示兩個(gè)菌株都含有一個(gè)70 kbp大小的質(zhì)粒，兩個(gè)PVA1的序列同源性達(dá)到98%~99%。這個(gè)AHPND相關(guān)質(zhì)粒被命名為PVA1。此質(zhì)粒上帶有與光桿菌同源的昆蟲相關(guān)的毒素（“Photorhabdus insectrelatedPir toxins，PirA and PirB）[12]。在自然缺乏或是基因刪除此Pir毒素的試驗(yàn)中，致病株明顯失去致病能力，所以副溶血弧菌的Pir毒素是引起AHPND的關(guān)鍵。然而PVA1質(zhì)粒是如何進(jìn)入對(duì)蝦體內(nèi)的，目前尚不太清楚。

經(jīng)過序列比對(duì)，本研究擴(kuò)增的所有陽性片斷都與Lee等所得到的序列有99.9%的同源性，結(jié)果一致，說明本研究采用的陽性菌株檢測(cè)方法與Lee等所提出的檢測(cè)方法可以相互對(duì)應(yīng)，可以用毒素質(zhì)?；蜻M(jìn)行病原檢測(cè)。

本研究在進(jìn)行肝胰腺菌株和增菌液劃板培養(yǎng)時(shí)，所挑取的TCBS和顯色培養(yǎng)基中的共60個(gè)單菌落都不是致病性副溶性弧菌菌株。這提示非致病性副溶血弧菌在肝胰腺中廣泛和大量存在，與致病性副溶血弧菌菌株一起存活。

本研究對(duì)肝胰腺組織不進(jìn)行增菌培養(yǎng)而直接抽提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直接進(jìn)行組織抽提沒有檢出陽性，與增菌后的菌液PCR檢測(cè)結(jié)果相比，敏感性非常低，所以在病原檢測(cè)時(shí)應(yīng)選擇肝胰腺增菌后的菌液。

OIE在《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》關(guān)于AHPND一章的征求意見稿中，曾提出只有需要分離出菌株后，才能確診為陽性；隨后2016年2月又改為需要進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)致病因果關(guān)系。本研究認(rèn)為這兩種要求均不具有可操作性。首先，副溶血弧菌廣泛存在于環(huán)境中，將增菌液或組織勻漿液涂布于平板培養(yǎng)后，能挑選到攜帶質(zhì)粒的單菌落的概率很小，而且AHPND肝胰腺增菌混合液在反復(fù)增菌后，PCR擴(kuò)增不出陽性條帶，樣品中的優(yōu)勢(shì)菌可能在反復(fù)增菌過程中逐漸取代了AHPND致病毒菌，使得毒素基因很難再被檢測(cè)到。其次，關(guān)于感染實(shí)驗(yàn)，需要使用SPF級(jí)別的敏感宿主南美白對(duì)蝦或斑節(jié)對(duì)蝦，需要具備一定級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室條件和設(shè)備，可操作性低。因此，本研究認(rèn)為只要獲得了含有攜帶毒素質(zhì)粒的混合菌液，結(jié)合PCR和測(cè)序比對(duì)，就能確認(rèn)為AHPND陽性。

Kongrueng等[13]從泰國(guó)南部發(fā)現(xiàn)了幾株具有血清學(xué)相似性AHPND副溶血弧菌，它們的脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜密切相似。由此他們推斷，這些菌株可能都起源于一個(gè)單一的克隆，但目前仍缺乏說服力。因?yàn)檫@些菌株都來自于單一的地理區(qū)域，缺乏地理多樣性。而在其它報(bào)道中[14]，也都是從一個(gè)區(qū)域的養(yǎng)殖場(chǎng)樣品中分離出不同的AHPND致病株。PVA1 質(zhì)粒來源于單一的副溶血弧菌菌株，還是來源于不同的菌株，目前還不清楚。若想有效解決這個(gè)問題，必須使AHPND致病菌株具有廣泛的地理多樣性。本次檢測(cè)可以為國(guó)內(nèi)外AHPND病原檢測(cè)提供很好的經(jīng)驗(yàn)，為今后的AHPND的病原檢測(cè)提供重要的檢驗(yàn)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Analysis on the Test Result of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease from Imported Penaeus vannamei Broodstock

Zhang Na1，Wang Jinjin2，Xie Yanhui1，Yu Li2，Li Jiaqiao1，Liu Ying2
（1. Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang，Guangdong 524000；2. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

Abstract：Acute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND）is an emerging disease causing enormous loss to shrimp aquaculture. The pathogen is a kind of Vibrio parahaemolyticus with plasmid of toxin，but its detailed pathogenic mechanism is still unclear. The primers targeting toxin plasmid were used to detect AHPND from a batch of imported Penaeus vannamei broodstock in this study. The PCR results showed that the same sized band confirmed AHPND was positive. Analysis on the results and processes of performance provided important data for AHPND detection in China.

Key words：AHPND；EMS；toxin plasmid；PCR amplification

中圖分類號(hào)：S945.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）07-0090-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.027

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010IK007）