岑萬 江鑫 周翊韜

摘 要：為構(gòu)建基于Cytb基因的雙齒圍沙蠶分子鑒定方法，以福建省沿海養(yǎng)殖的雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）為供試材料，采用DNA測序方法獲得雙齒圍沙蠶的線粒體Cytb基因序列，并對其進行分子鑒定;進一步采用Mega4軟件的鄰接法（NJ法）構(gòu)建沙蠶亞科Cytb基因的進化樹。結(jié)果表明：雙齒圍沙蠶的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序和Blast比對后，雙齒圍沙蠶的Cytb基因序列長度為349 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫雙齒圍沙蠶有97%～99%的相似度，并沒有與其他種沙蠶具有相似度;沙蠶亞科進化樹中，雙齒圍沙蠶與多齒圍沙蠶相聚，兩者相聚后再與闊沙蠶屬相聚，沙蠶屬與環(huán)唇沙蠶屬相聚、擬突沙蠶屬與刺沙蠶屬相聚;研究結(jié)果初步證實了線粒體Cytb基因序列可用于雙齒圍沙蠶的分子鑒定。

關(guān)鍵詞：雙齒圍沙蠶; Cytb基因; PCR鑒定; 進化樹

Abstract： In order to construct the molecular identification method of Perinereis aibuhitensis based on Cytb gene， by taking Perinereis aibuhitensis cultured in coastal Fujian as the test material， the mitochondrial Cytb gene sequences of Perinereis aibuhitensis were obtained by using DNA sequencing and its molecular identification was carried out. Furthermore， the neighbor-joining method （NJ method） in Mega4 software was used to construct the phylogenetic tree of Cytb genes in the subfamily. The results showed that after sequencing and Blast aligning of PCR amplified products of Perinereis aibuhitensis， the Cytb gene sequence length of Perinereis aibuhitensis was 349 bp， which was 97%-99% similar to Perinereis aibuhitensis in NCBI database， but was not similar to other species of nereid. In the phylogenetic tree of subfamily sericulaceae， Perinereis aibuhitensis and Perinereis nuntia came together first， and then they were together with Platynereis; Nereis and cheilonereis came together， and so did Paraleonnates and Neanthes Kinberg. The results preliminarily confirmed that the mitochondrial Cytb gene sequence could be used for the molecular identification of Perinereis aibuhitensis.

Key words： Perinereis aibuhitensis; Cytb gene; PCR identification; Phylogenetic tree

沙蠶Nereis succinea由頭部、尾部、軀干部構(gòu)成，整體為長柱形蠕蟲狀。著名分類學家林奈將其隸屬蠕蟲綱、軟體動物目，后續(xù)的分類學家又將其隸屬環(huán)節(jié)動物門、多毛綱。在我國近海，沙蠶共有81種，其中雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis屬于沙蠶亞科的圍沙蠶屬，廣泛分布在中國近海、東南亞、印度洋流域[1]，屬于福建省沿海的主要經(jīng)濟沙蠶品種。雙齒圍沙蠶作為重要的無脊椎海洋經(jīng)濟物種，在環(huán)境監(jiān)測、海洋藥物開發(fā)、餌料利用、人工養(yǎng)殖等方面都有著重要的研究價值[2]。有研究表明，雙齒圍沙蠶對汞的污染有高敏感度，可用于監(jiān)測海洋重金屬的污染[3]。雙齒圍沙蠶制成的復合膠囊能夠保護膠囊免受胃酸的影響，且能夠提高體內(nèi)藥效[4]。雙齒圍沙蠶是魚類優(yōu)良的餌料，甚至有“萬能餌料”稱號。隨著國內(nèi)外海釣業(yè)的不斷發(fā)展，沙蠶需求量劇增，作為優(yōu)質(zhì)餌料的雙齒圍沙蠶價格大幅升高，其人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展[5]。

沙蠶由于形態(tài)相近，成體特別是幼體的沙蠶通過外觀更是難以區(qū)分。目前對雙齒圍沙蠶鑒定主要依靠形態(tài)學，但圍沙蠶屬的幾種沙蠶形態(tài)相似，且因環(huán)境與地點的不同時常會產(chǎn)生變種[1]。因此尋找一種準確高效的鑒定方法對雙齒圍沙蠶的研究很有意義。此外，雙齒圍沙蠶與其他的圍沙蠶在形態(tài)上主要區(qū)別是口環(huán)部牙齒的數(shù)目與分布，但是由于沙蠶的口器包裹在體內(nèi)，一般的形態(tài)學不易觀察，因此急需一種除了形態(tài)學以外的鑒定方法。物種鑒定是研究生物多樣性的核心，除了傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法，近年來也有研究者利用DNA進行分子鑒定[6]。線粒體DNA是DNA分子標記的一種，其具有結(jié)構(gòu)單一、進化速度快、分子較小的優(yōu)點，用于分子標記鑒定有較好效果[7]。Cytb（細胞色素b）基因存在于線粒體DNA中，Cytb蛋白對呼吸鏈的電子轉(zhuǎn)移有重要影響[8]。不同區(qū)域的線粒體DNA進化速度有差異，與12S rDNA和16S rDNA相比，線粒體蛋白編碼基因Cytb進化得更快，更適宜利用于分子鑒定的研究[9]。目前Cytb基因已經(jīng)被廣泛用于海洋物種鑒定中，Madisha[10]利用部分Cytb基因鑒定兩種南非的水獺，

Cutarelli[11]利用Cytb基因?qū)σ獯罄袌龀Ｒ婔~類進行鑒定。但是同樣作為海洋動物的雙齒圍沙蠶Cytb基因鑒定卻鮮見報道。因此，本研究根據(jù)已公布的雙齒圍沙蠶的線粒體序列，利用Cytb基因設(shè)計特異性引物，進行雙齒圍沙蠶分子鑒定的研究，進一步采用NJ法構(gòu)建沙蠶亞科Cytb基因的進化樹，探究了沙蠶亞科間的親緣關(guān)系，旨在為沙蠶物種的鑒定和分類研究提供理論指導和實際參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis取自福清市融盛養(yǎng)殖場。

1.2 試驗試劑與設(shè)備

1.2.1 試劑 蛋白酶K、Quick-DNA Universal Kit試劑盒（Zymo公司）、瓊脂糖（SIGMA公司）、引物（福州擎科生物技術(shù)有限公司合成）、PCR mixture（全式金公司）、DNA marker（Thermo公司）。

1.2.2 試驗設(shè)備 主要試驗設(shè)備有解剖鏡、體視熒光顯微鏡、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、Nanodrop分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑盒法提取雙齒圍沙蠶的基因組DNA 采用Quick-DNA Universal Kit試劑盒提取基因組，取0.05 g的雙齒圍沙蠶肌肉組織放入EP管，剪碎后加入95 μL無菌水、95 μL Solid Tissue Buffer（blue）和10 μL蛋白酶K。將EP管放入55℃的水浴鍋中水浴1.5 h。當組織溶解后，12000 r·min-1離心10 min，取上層液150 μL，移入新的EP管，加300 μL的Genomic Binding Buffer溶液混合均勻?；旌弦恨D(zhuǎn)入Zymo-spin IIC-xl 小管中，12000 r·min-1離心1 min，棄掉下管的液體。再加400 μL的DNA pre-wash Buffer到小管，12000 r·min-1離心1 min。然后加700 μL的g-DNA wash Buffer液體到小管，12000 r·min-1速度下離心1 min，棄掉下管的液體。最后加入37 μL雙蒸水。12000 r·min-1離心1 min后得到DNA溶液，之后進行電泳，并用Nanodrop測定DNA完整度和純度。

1.3.2 雙齒圍沙蠶Cytb基因片段的克隆和序列測定 在NCBI數(shù)據(jù)庫上查找雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）的線粒體基因組序列，NCBI登錄號為NC_023943.1。根據(jù)線粒體基因組的注釋信息找到沙蠶的Cytb基因信息，并用fasta格式導出。設(shè)計引物：上游引物的位置為6100～6200，下游引物的位置為6250～6530。正反向引物序列如下：

據(jù)梯度PCR確定最適溫度57℃，在此溫度下進行PCR產(chǎn)物的大體系擴增。PCR 100 μL體系如下：2 μL模板DNA、1 μL上下游引物、2×PCR mixture 50 μL和無菌水46 μL。分別以供試4種沙蠶的基因組DNA作模板，放入PCR儀擴增。擴增程序為：預變性94℃ 7 min，變性94℃ 1 min，復性57℃ 45 s，72℃延伸2 min，擴增35個循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸7 min。預期擴增片段大小349 bp，將PCR產(chǎn)物進行1%的凝膠電泳，選擇亮度完好、有特異性條帶的PCR產(chǎn)物送到公司測序。

1.3.3 進化樹分析 用Mega4軟件的NJ法構(gòu)建基于Cytb基因和氨基酸序列的沙蠶亞科的進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙齒圍沙蠶的基因組DNA提取

在解剖鏡下分別取4種沙蠶肌肉組織0.05 g，用試劑盒法提取。結(jié)果如圖1所示，獲得的基因組DNA片段大小都在10000 bp以上。所提取的基因組DNA大小完整，有清晰的條帶，說明該試劑盒能有效地提取雙齒圍沙蠶基因組DNA。進一步對DNA的純度進行檢測，濃度均在20 ng·μL-1左右，A260/280均在1.80左右。說明提取的DNA純度高，無RNA、蛋白質(zhì)污染，可以進行下一步PCR擴增反應。

2.2 雙齒圍沙蠶的Cytb基因片段擴增

將4個沙蠶的DNA樣品作為模板，用所設(shè)計的引物在57℃的退火溫度下進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，所擴增的4種沙蠶的片段都在350 bp左右，與引物設(shè)計目標產(chǎn)物349 bp相符，條帶單一，沒有雜帶。說明可以成功擴增出雙齒圍沙蠶的Cytb基因部分片段。為了進一步獲取PCR產(chǎn)物的序列，將4個PCR擴增產(chǎn)物送去公司測序。

2.3 雙齒圍沙蠶的Cytb基因的比對分析

將4個雙齒圍沙蠶樣品的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過膠回收后，送測序公司進行序列測定。測定的序列峰圖完整，沒有重疊峰的出現(xiàn)，表明所得到的PCR產(chǎn)物均為單一條帶。將測序得到的雙齒圍沙蠶的Cytb部分序列在NCBI上Blast比對鑒定，比對結(jié)果如圖3所示。從圖3A可以看出，Graphic Summary只有1條代表高分的線條（相似度98%，即最長的線條），該線條的比對結(jié)果是雙齒圍沙蠶的線粒體DNA序列（Perinereis aibuhitensis mitochondrion，complete genome），其余的線條代表的物種是紅獵蝽蟲（Rhodnius robustus isolate roBR6o cytochrome b gene， partial cds）和粗糙外刺猛蟻（Ectatomma ruidum isolate 2098_SG_B cytochrome b gene， partial cds）等，比對率均在23%以下，說明擴增出的Cytb部分基因能特異性地比對到雙齒圍沙蠶的Cytb基因。從圖3B可以看出，PCR產(chǎn)物的序列與雙齒圍沙蠶的線粒體基因組（KF611806.1）上的Cytb基因一致度達到99%，只有2個序列Gaps出現(xiàn)。其余3種雙齒圍沙蠶PCR產(chǎn)物序列的Blast結(jié)果與圖3基本一致，不再

呈現(xiàn)結(jié)果。因此，擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過Blast比對，證明了本研究設(shè)計的引物能正確擴增出雙齒圍沙蠶的Cytb基因的部分序列，可以成功用于雙齒圍沙蠶的分子鑒定。

2.4 沙蠶亞科的Cytb基因進化樹分析

從NCBI下載沙蠶亞科中7種沙蠶Cytb基因，種屬名與NCBI登錄號列于表1。以磯沙蠶科的巖蟲為外群，構(gòu)建自展數(shù)為1000的NJ法沙蠶亞科進化樹。利用沙蠶亞科Cytb基因的進化樹如圖4所示，從圖4可以看出雙齒圍沙蠶與多齒圍沙蠶相聚，說明兩者均為圍沙蠶屬;兩者相聚后再與闊沙蠶屬相聚，說明闊沙蠶屬在進化位置更靠近圍沙蠶屬;沙蠶屬與環(huán)唇沙蠶屬相聚、擬突沙蠶屬與刺沙蠶屬相聚。將進化樹與《中國近海沙蠶科研究》中利用形態(tài)與功能建立的形態(tài)學分類樹進行比較，對于雙齒圍沙蠶的分類地位相一致，都是將雙齒圍沙蠶與多齒圍沙蠶劃分為圍沙蠶屬，不同的地方是刺

3 討論

雙齒圍沙蠶的研究價值較高，可作為良好的海洋模式動物和經(jīng)濟餌料生物進行各類研究，利用形態(tài)學對其分類，存在易形成誤差、樣本量多、不能分析基因?qū)哟蔚奈⒂^變化情況等缺點[12]。因此，進行雙齒圍沙蠶分子鑒定研究極為重要。利用Cytb基因進行分子鑒定，是因為Cytb基因作為分子標記基因能有效鑒定物種。鄧園等[13]研究結(jié)果表明對于雙齒圍沙蠶Cytb基因片段可能更適合用于群體遺傳分化研究，因其比COI基因片段更敏感。線粒體全基因組測序技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)有較多的沙蠶都已經(jīng)明確線粒體全基因組，這為本研究創(chuàng)造了外部條件。本研究自行設(shè)計的引物能擴增出349 bp的序列長度，4種雙齒圍沙蠶在Blast上的相似率達97%～99%，無其他沙蠶的干擾項，說明Blast比對結(jié)果良好，對于雙齒圍沙蠶的區(qū)分度非常大。本研究構(gòu)建了基于Cytb基因鑒定雙齒圍沙蠶的分子鑒定方法，為雙齒圍沙蠶這一海洋經(jīng)濟物種的科學鑒定提供了理論指導，有利于未來種質(zhì)保護、養(yǎng)殖業(yè)的純種鑒定等，更為未來難以用形態(tài)學鑒定的物種提供了分子鑒定的借鑒。隨著測序技術(shù)發(fā)展及研究的深入，越來越多的沙蠶亞科的Cytb基因?qū)⒈粶y出，沙蠶亞科各物種之間的親緣關(guān)系將進一步得到完善，今后將有望徹底理清沙蠶亞科的系統(tǒng)進化關(guān)系。

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（責任編輯：林玲娜）