延邊大學附屬醫(yī)院胃腸外科(延吉 133000)

于　洋　許　臻　李　革▲

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X線照射對不同放射敏感性大腸癌細胞中ATM mRNA表達的影響*

延邊大學附屬醫(yī)院胃腸外科(延吉 133000)

于洋許臻李革▲

摘要目的：探討大腸癌細胞株HM7、HT29間輻射敏感性差異與共濟失調毛細血管擴張癥突變(ATM)基因的關系。方法：應用半定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法，分析10Gy X線照射前后HM7、HT29中ATM mRNA表達水平變化。結果：在X線照射前，HT29中ATM mRNA水平比HM7高;在照射后，HM7細胞的ATM mRNA水平在早期(1h)就出現(xiàn)輕度上升(是基礎水平的1.4倍);而HT29細胞在照射后4h才表現(xiàn)為ATM mRNA量上升(是基礎水平的1.6倍):兩者在照射后12h左右ATM mRNA表達水平恢復接近基礎水平。結論：經X線照射后，在對放射相對敏感的HT29與對放射相對抗拒的HM7細胞中，ATM mRNA水平變化規(guī)律存在差異。這種ATM mRNA表達的不同可能是導致兩者放射敏感性不同的原因之一。

主題詞腸腫瘤共濟失調毛細血管擴張癥突變蛋白/免疫學輻射效應X線衍射

研究表明，HT29對放射線的敏感性要比HM7要高[1]，究其原因還沒有明確的解釋。根據(jù)現(xiàn)有的研究報告可知，影響細胞放射敏感性主要有兩方面，一是DNA損傷修復，二是細胞周期調控。大量研究表明ATM基因對DNA損傷識別、信號轉導、細胞周期調控有著重要的影響[2]。ATM基因是磷酸肌醇激酶-3(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)基因家族成員。ATM蛋白分子量約為350kD，是ATM即共濟失調毛細血管擴張癥(Ataxiatelangiectasia，AT)的致病基因的蛋白。本實驗采用RT-PCR方法，用放射線對HT29和HM7加以處理后，基于分子水平上，論證ATM基因表達與HT29、HM7的放射敏感性差別之間的聯(lián)系。本實驗可為大腸癌放射生物學提供實驗數(shù)據(jù)。

材料與方法

1細胞株人大腸癌細胞株HT29、HM7由韓國忠南大學校醫(yī)科大學分子生物學教研室提供。用含10%小牛血清(國產)DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

2研究方法

2.1RNA的提取及其質量鑒定：采用指數(shù)生長期的細胞(低溫環(huán)境)，在研缽中充分研碎，用Trizol提取總RNA。RNA濃度和A260/A280值用光密度測定儀檢測，并對其純度進行鑒定。同時還要對RNA樣本的完整性進行鑒定，采用紫外線檢測儀觀察RNA瓊脂糖凝膠電泳中28s、18s、5s條帶特征。

2.2 引物設計及其合成：ATM引物用PRIMER 3OUT軟件，基于Gen Bank數(shù)據(jù)庫中ATM基因mRNA序列提供的數(shù)據(jù)設計而成，并由上海生工生物工程公司實物。合成的引物序其上游5′ -CGGGATCCAGCTATTTGGTTTG-3′，合成的引物序其下游5′-CGGAATTCACACCTTCAACACCCGTAAT-3′。β-actin引物序列根據(jù)文獻[3]設計而成。

2.3RT-PCR：在20μl逆轉錄體系中加入模板RNA 1μl，細胞的總RNA達0.1～1.0μg Oligo(aT)18(0.2μg/μl)4μl，用DEPC處理的雙蒸水補足體積至15μl。70℃加熱5min，迅速置于冰上，短暫離心。上述微量離心管內加入：10×反應緩沖液2μl，4×dNTP mix(每種10mmol)1μl，RNA酶抑制劑(40U/μl)0.5μl，M-MuLV逆轉錄酶(200U/μl)1μl，38℃恒溫60min，進行逆轉錄反應。70℃加熱10min，滅活逆轉錄酶活性。取10μl逆轉錄產物作PCR擴增，PCR參數(shù)：94℃45s、55℃45s、72℃ lmin，進行30次循環(huán)后(循環(huán)次數(shù)是根據(jù)其擴增動力學實驗確定的)，72℃延伸6min。以GAPDH作內參照。PCR產物作2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙淀染色并分析。

2.4mRNA定量：內參照以β-actin mRNA為基準。ATMcDNA條帶和β-actin cDNA條帶都應該同時出現(xiàn)在PCR擴增產物中。借助紫外線數(shù)字成像儀，對陽性條帶進行密度掃描。根據(jù)掃描結果，進一步計算出mRNA指數(shù)Ri(mRNA index)，它代表ATM mRNA在細胞中的濃度。其計算公式如下：

進行3次實驗，分別測量HT29、HM7中ATM mRNA在X射線照射前后的指數(shù)，再計算其均值并比較。

2.5X線照射：被照射的細胞選定為指數(shù)生長期的細胞，用10Gy劑量的F-43型深部X線治療機(北京東方紅醫(yī)療器械廠)進行照射。照射前首先對照射劑量率進行測量，調整至96.6cGy/min，除此之外還要矯正玻璃培養(yǎng)瓶的衰減率。最后在12mA電流、210kV電壓、0.51mmCu半價層、0.25mmCu濾過板、10cm×15cm照射視野的照射條件下進行照射。

2.6統(tǒng)計學方法：采用配對t檢驗對兩組數(shù)據(jù)進行比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

1RNA質量鑒定RNA的純度可以通過A260/A280值得出結論，所提取的RNA樣本經過光密度測定儀測得A260/A280值在1.8～1.9之間，RNA純度較好。通過紫外線檢測儀，可以看到在1.2%瓊脂糖凝膠電泳中28s、18s、5s三條帶(圖1)。從圖中可以清晰的看到，18s帶亮度約為28s的一半，這說明被提取的RNA未被過多降解，其完整性較好。

圖1　細胞總RNA電泳

2RT-PCR結果在RT-PCR方法的結果中，出現(xiàn)了兩條陽性條帶，這說明ATM蛋白的cDNA和β-actin的cDNA存在于從HM7、HT29中提取的mRNA中。在此之后，借助UTHSCSAimage Tool分析軟件計算兩條陽性條帶的光密度值，再進一步計算所需的Ri值(圖2)。

圖2　HT29、HM7中 RI值

討論

近年來，放射線廣泛應用于臨床治療大腸癌。但是，部分患者對放療不敏感，研究大腸癌輻射敏感性有助于提高大腸癌放療治療效果，對臨床來說有很大的意義。ATM基因突變與細胞特殊輻射敏感性的關系，使其成為研究大腸癌細胞輻射增敏的一個重要的契入點。但是目前對于這方面的研究相對較少。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，ATM基因存在于大腸癌組織中，它與放療的敏感性有著緊密的聯(lián)系[3-4]。前一階段的實驗中，借助熒光免疫化學法，我們發(fā)現(xiàn)，ATM蛋白綠色FiTC熒光產物存在于HM7細胞核和細胞漿中，而且有60%～80%細胞的核具有較強的表達。但這種ATM蛋白水平的表達差異是否因其mRNA水平差異所致，以及HM7、HT29在受到電離輻射發(fā)生DNA損傷后，ATM mRNA 的反應如何，正是我們想進一步探討的問題。

根據(jù)實驗結果可知，未經X射線處理的兩種癌細胞ATM mRNA基礎含量Ri，HT29比HM7稍微低一些，經X線(10Gy)照射1 h后HT29中Ri值明顯上升，約為初值的1.6倍，但HM7數(shù)值輕微下降。照射4 h后HT29值有所下降，HM7明顯提升。照射12 h后HM7值顯著下調，HT29值略為平穩(wěn)?？梢姺派湎鄬咕艿腍M7中，ATM mRNA水平在DNA受到X射線損傷后上升明顯；然而，ATM mRNA水平在對放射相對敏感的HT29中卻并沒有太明顯的變化。

研究表明，ATM基因的3′端序列與PI3K的序列具有同源性，因此DNA-PK和ATM基因都是PI3K基因家族的范疇。ATM基因在DNA損傷、修復還有細胞周期反應信號傳導中都起著重要作用[5-6]。細胞由于受到放射性損害而導致雙鏈DNA斷裂，通過刺激細胞周期檢測點信號轉導系統(tǒng)，生理性ATM使受損細胞在各自的細胞周期停滯，并對其進行DNA修復；一旦ATM受損或者功能缺失，細胞的這種自我保護機制將消失，這將導致細胞周期停滯減弱，細胞發(fā)生癌變或者死亡的幾率將大大增加。在細胞周期檢測點信號轉導通路網絡中，G1/S期檢測點的激活主要是借助ATM激活p53、p21等基因實現(xiàn)，S期和G2/M期檢測點的激活主要是借助ATM激活chk1、chk2和cdc25、cdc2來實現(xiàn)。一旦ATM表達受到影響，將會阻礙細胞周期檢測點發(fā)揮其應有的功能，細胞周期在遇到損傷時將無法阻滯，并進一步導致癌變或者死亡。由此可知，細胞放射敏感性與ATM的功能狀態(tài)、表達量功能狀態(tài)有著密切的聯(lián)系。Guha[7]借助腦膠質瘤細胞ATM的反義RNA，通過其抑制腦膠質瘤細胞ATM蛋白的表達，實現(xiàn)了細胞放射敏感性的提高。再如基因治療或激酶抑制劑等也是通過抑制ATM蛋白表達，成功實現(xiàn)細胞對放射線的敏感性的提高[8-9]，制造ATM基因突變狀態(tài)，使ATM基因功能受到抑制[10-11]，誘發(fā)ATM基因產物表達下降[12]，都可以提高癌細胞對輻射的敏感性，這些都是提高放射治療效果不錯的方法。有研究表明[13]，ATM基因PI3K功能區(qū)的突變與細胞輻射敏感性的變化有密切的聯(lián)系。同時，也有相關實驗證實，細胞輻射敏感性會隨著ATM/PI3K功能區(qū)的表達受抑制而發(fā)生變化[14]。

根據(jù)實驗結果，我們可以得出結論，對放射相對敏感的HT29與對放射相對抗拒的HM7相比，其ATM蛋白表達水平要高。本次實驗再次證明了大腸癌細胞放射敏感以及抗拒性與ATM基因表達有密切的聯(lián)系，這為大腸癌放療增加療效提供了理論基礎。

參考文獻

[1]李革，李香俊，羅強，等. ATM蛋白在不同放射敏感性大腸癌細胞株中的表達[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志, 2010,23:3559-3561.

[2]Lavin MF. Ataxia-telangiectasia: From arare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008,9:759-769.

[3]李革，李林虎，尹玩熙. 凋亡相關基因與直腸癌放射敏感性相關關系的研究[J]. 陜西醫(yī)學雜志，2008,37(2):131-133.

[4]李革，李林虎，尹玩熙. 直腸癌自發(fā)性細胞凋亡、ATM蛋白表達和放射敏感性關系的研究[J]. 廣東醫(yī)學，2008,29(3):50-52.

[5]Riches LC, Lynch AM, Gooderham NJ. Early events in the mammalian response to DNA double-strand breaks[J]. Mutagenesis, 2008,23:1409-1421.

[6]Czornak K, Chughtai S, Chrzanowska KH. Mystery of DNA repair:The role of the MRN complex and ATM kinase in DNA damage repair[J]. J Appl Genet, 2008,49:383-96.

[7]Guha C, Guha U, Tribius S,etal. Antisense ATM gene therapy: A strategy to increase the radiosensitivity of human tumors [J].Gene Ther, 2000,7:852-858.

[8]Zou J,Qiao X,Ye H,etal. Antisense inhibition of ATM gene enhances the radiosensitivity of head and neck squamous cell carcinoma in mice[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2008,27:56.

[9]Sabisz M, Skladanowski A. Modulation of cellular response toanticancer treatment by caffeine: inhibition of cell cycle cheekpoints, DNA repair and more[J]. Curr Pharm Bioteehnol, 2008,9:325-336.

[10]Cortes ML, Oehmig A, Saydam O,etal. Targeted integration of functional human ATM cDNA into genome mediated by HSV/AAV hybrid amplicon vector[J]. Mol Ther, 2008,16:81-88.

[11]Ahmed KM, Li JJ. ATM-NF-kappa B connection as a target for tumor radiosensitization[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2007,7:335-42.

[12]WILliams JR, Zhang Y, Russell J,etal. Human tumor cells segregate into radiosensitivity groups that associate with ATM and TP53 status[J]. Acta Oncol, 2007,46:628-38.

[13]Morgan SE, Lovly C, Padnita TK,etal. Fragments of ATM which have dominant-negative or complementing activity[J]. Mol Cel Biol, 1997,17:2020-2029.

[14]Guha C, Guha U, Tribius S,etal. Antisense ATM gene therapy: A strategy to increase the radiosensitivity of human tumors[J]. Gene Ther, 2000,7:852-858.

(收稿:2015-12-11)

通訊作者：▲延邊大學附屬醫(yī)院胃腸外科

【中圖分類號】R392.3

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.01

Effect of X-ray irradiation on the expression of mRNA ATM in colorectal cancer cells with different radiosensitivity

Surgery Department of Gastrointestinal, Yanbian University Hospital(Yanji 133000)

Yu YangXu ZhenLi Ge

ABSTRACTObjective: To investigate the relationship between ataxia-telangiectasia mutant (ATM) gene and the different radiosensitivity of two nasopharyngeal colorectal cell lines, that is HM7 and HT29. Methods: Semi-quantitive reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to measure the level of ATM mRNA in HM7 and HT29 when exposed to 10 Gy X-rays irradiation. Results: Without irradiation, the basic ATM mRNA levels in HT29 were slightly lower than in HM7. After 1 hour of irradiation, the ATM mRNA levels of HT29 increased to 1.6 times than basic levels. But the ATM mRNA levels of HM7 increased to 1.4 times than basic levels after 4 hours of irradiation respectively. At last, returned to basic levels at 12 hours after irradiation. Conclusion: After X-ray irradiation, in the cells of HT29 which is sensitive to radiation and HM7 with radiation resistance, their variation of ATM mRNA levels was different. it might be one of the reasons of different radiosensitivity.

KEY WORDSIntestinal neoplasmsAtaxia telangiectasia mutated proteins/immunologyRadiation effectsX-Ray diffraction

·論著·基礎研究·

*國家自然科學基金資助項目(30960368)