李鋒濤，林磊，程斌

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·基礎(chǔ)研究·

人參皂苷Rg1對大鼠脊髓缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

李鋒濤1，林磊2，程斌1

［摘要］目的探索人參皂苷Rg1對于大鼠脊髓缺血再灌注損傷（SCII）后細胞凋亡的影響。方法成年健康Sprague-Dawley大鼠48只，隨機分為假手術(shù)組（n=8）、缺血組（n=8）、再灌注組（n=16只）和藥物組（n=16）。假手術(shù)組僅安放球囊不阻斷血流；缺血組脊髓缺血30min；藥物組大鼠分別于脊髓缺血前30min及術(shù)后腹腔注射人參皂苷Rg1 30mg/kg；再灌注組與藥物組相同時間點注射相同體積生理鹽水。假手術(shù)組、缺血組于缺血后30min，藥物組和再灌注組于再灌注后6h及24h應(yīng)用HE染色檢測細胞形態(tài)改變，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl-2及survivin表達。結(jié)果缺血組、再灌注組及藥物組HE染色均有神經(jīng)元損傷，藥物組損傷較其他兩組明顯減輕。缺血組、再灌注組和藥物組survivin、Bcl-2陽性細胞明顯高于假手術(shù)組（t＞3.896，P＜0.01）。藥物組6h、24h survivin及Bcl-2蛋白陽性細胞均較再灌注組顯著增加（t＞6.693，P＜0.001）。結(jié)論人參皂苷Rg1可減少早期大鼠SCII后神經(jīng)元損害，增加抗凋亡蛋白survivin、Bcl-2的表達，抑制凋亡。

［關(guān)鍵詞］脊髓損傷；缺血再灌注損傷；人參皂苷Rg1；凋亡；大鼠

［本文著錄格式］李鋒濤，林磊，程斌.人參皂苷Rg1對大鼠脊髓缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（6）：650-654.

CITED AS：Li FT，Lin L，Cheng B.Effect of Ginsenoside Rg1 on apoptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：650-654.

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII）是由于脊髓局部缺血，引起興奮性氨基酸毒性作用、大量氧自由基生成和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致多種炎性介質(zhì)釋放、神經(jīng)細胞變性、壞死和程序性凋亡的復(fù)雜過程。其中，神經(jīng)細胞凋亡越來越被重視。人參皂苷Rg1是人參皂苷最主要的活性成分之一［1］，具有抗氧化、抗細胞凋亡、提高免疫力、減少細胞腫脹等作用。研究顯示人參皂苷Rg1能明顯減輕腎、腦等臟器缺血再灌注損傷［2］，但在SCII方面報道較少。本實驗旨在觀察人參皂苷Rg1對于SCII后神經(jīng)細胞凋亡的影響，探討其在臨床中的意義。

1　材料與方法

1.1主要儀器及試劑

survivin及Bcl-2大鼠單克隆抗體：美國SANTACRUZ公司。SP免疫組化試劑盒：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Fogarty導(dǎo)管：美國EDWARDS LIFESCIENCES公司。圖像信號采集與分析系統(tǒng)（Q500IW）：德國LEICA公司。

1.2動物分組

成年健康清潔級Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量（209±16）g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。將動物編號后，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=8）、缺血組（n=8）、再灌注組（n=16）和藥物組（n=16）。

1.3造模

所有動物術(shù)前禁食12h，不禁水。3%苯巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉。顯露左側(cè)頸總動脈及尾動脈，置入與監(jiān)護儀連接的PE50導(dǎo)管，監(jiān)測近、遠端血壓（近端導(dǎo)管連接放血裝置）。暴露左側(cè)股動脈，將2F Fogarty導(dǎo)管置入10.8～11.4cm，使得球囊位于左鎖骨下動脈分支處。充盈球囊，阻斷胸主動脈，同時立即通過放血裝置開始放血，將近端平均動脈壓維持在45 mmHg。30min后，放松球囊，恢復(fù)胸主動脈血流，將所放出的血液勻速回輸。術(shù)后皮下注射硫酸魚精蛋白4mg。將動物置于25～30℃的保溫箱內(nèi)，等待動物蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。

假手術(shù)組僅安放球囊不阻斷血流。

1.4方法

藥物組大鼠脊髓缺血前30min腹腔注射人參皂苷Rg1 30mg/kg，術(shù)后腹腔注射人參皂苷Rg1 30mg/ kg。再灌注組相同時間點注射相同體積生理鹽水。術(shù)后所有大鼠均在SPF清潔級實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，自由進食及飲水。整個實驗過程中各組死亡的動物分別在相同條件下予以補充。

1.5標本采集

假手術(shù)組，缺血組于缺血后30min，藥物組和再灌注組于再灌注后6h（n=8）及24h（n=8）行4%多聚甲醛灌注后取出標本進行石蠟包埋，于L3節(jié)段2mm范圍內(nèi)連續(xù)切片，厚度為10 μm。

1.6HE染色

各組動物分別于缺血后及再灌注6h、24h分別進行HE染色，觀察各組脊髓內(nèi)細胞形態(tài)變化。切片在二甲苯I、二甲苯Ⅱ中各脫蠟10min；無水乙醇2min，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇各1min，蒸餾水洗2min；蘇木素5min，清水沖洗；0.5%鹽酸乙醇（70%乙醇配制）分化，提插數(shù)下，清水浸泡15min；0.5%伊紅染液染色2min；80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇及無水乙醇中各1min；二甲苯透明2次，各5min，中性樹脂封片。光鏡下觀察。

1.7免疫組織化學(xué)染色

各組動物分別于缺血后及再灌注6h、24h分別進行損傷區(qū)脊髓組織Bcl-2及survivin染色，觀察各組脊髓內(nèi)Bcl-2及survivin表達量變化。二甲苯透明，梯度乙醇脫水，3%H2O2去離子水孵育30min，5%BSA封閉液封閉20min。滴加小鼠抗大鼠survivin/Bcl-2一抗（1：200），濕盒4℃孵育過夜，滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育20min。滴加SABC，室溫孵育15min。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明；中性樹脂封片。所有切片均應(yīng)用LEICA Q500IW圖像信號采集與分析系統(tǒng)進行圖像采集處理，每只動物觀察3張切片，每張切片隨機取5個視野，取平均值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1HE染色

假手術(shù)組脊髓組織神經(jīng)細胞飽滿，胞漿內(nèi)尼氏體清晰，細胞核邊界清楚，核仁清晰可見。缺血組神經(jīng)細胞皺縮，尼氏體模糊，細胞核邊界及核仁不清，神經(jīng)細胞數(shù)量減少。再灌注組再灌注6h后神經(jīng)細胞繼續(xù)皺縮，胞漿及細胞核結(jié)構(gòu)不清，尼氏體模糊，細胞數(shù)量減少；24h后神經(jīng)細胞數(shù)量顯著減少，胞體皺縮，細胞核及尼氏體等結(jié)構(gòu)不清，脊髓組織出現(xiàn)空泡。藥物組不同時間點均可見類似損傷性改變，但同再灌注組各亞組相比，損傷程度明顯較輕。見圖1。

2.2免疫組織化學(xué)染色

survivin及Bcl-2蛋白表達于胞漿。假手術(shù)組脊髓組織survivin、Bcl-2基本不表達。缺血組、再灌注組和藥物組survivin、Bcl-2陽性細胞明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。藥物組6h、24h survivin及Bcl-2蛋白陽性細胞均較再灌注組顯著增加（P＜0.001）。見表1、表2、圖2、圖3。

3　討論

SCII后，脊髓組織由于缺血缺氧、能量代謝障礙、多種炎性因子釋放［3-5］、活性氧族生成、Ca2+大量內(nèi)流等，均可激活細胞凋亡信號通路，引起神經(jīng)細胞的凋亡［6］。研究證實哺乳動物細胞凋亡主要通過兩條途徑［7］，外源性凋亡配體途徑的激活需要配體與所謂的細胞表面的死亡受體相結(jié)合，從而激活caspase-8［8］。內(nèi)源性途徑可被代謝、基因等其他因素所激活，導(dǎo)致線粒體完整性被破壞及線粒體通透性改變，該過程導(dǎo)致細胞色素C釋放［9］，從而激活起始因子caspase-9。無論哪種刺激，最終會激活起始caspases，使其下游caspases活性增高，導(dǎo)致凋亡［10］。

人參皂苷Rg1是從人參中提取的有效活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用［11-14］。其可通過抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-teminal Kinase，JNK）的磷酸化而阻斷JNK通路，減少線粒體損傷及抑制凋亡［15-16］；抑制細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達，減少炎性反應(yīng)；同樣也對腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α誘導(dǎo)的絲裂活化蛋白激酶激酶4（Mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4）的磷酸化及JNK-AP-1通路的激活有抑制作用［17］。王淑秀等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可抑制帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元EphB1、P-c-Jun蛋白表達，提高酪氨酸羥化酶表達，抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能［18］。黃天文等應(yīng)用人參皂苷Rg1處理寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可通過JNK信號通路減輕寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡［19］。在腎缺血再灌注損傷中，人參皂苷Rg1通過抑制Bax的表達抑制細胞的凋亡［20］。袁瓊蘭等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1通過促進凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP）的表達來抑制腦神經(jīng)細胞的凋亡［21］。亦有報道證實人參皂苷Rg1可調(diào)節(jié)ERK1/2和p-JNK的表達，減少腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡［22］。人參皂苷Rg1是否在SCII中同樣具有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用罕見報道。

表1　不同組別及各時間節(jié)點脊髓組織survivin平均灰度值（n=8）

表2　不同組別及各時間節(jié)點脊髓組織Bcl-2平均灰度值（n=8）

圖1　各組脊髓組織HE染色（400×）

圖3　各組脊髓組織Bcl-2表達（免疫組化染色，400×）

Bcl-2是細胞內(nèi)重要的抗凋亡蛋白，是線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中細胞內(nèi)關(guān)鍵的檢查點，可通過抑制促凋亡蛋白介導(dǎo)的凋亡［23-24］，保持線粒體膜的完整性，阻止線粒體膜通透性孔（permeability transition pore，PT孔）開放，減少細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等釋放，而抑制細胞的凋亡。survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）中最小的成員［25］，包括142個氨基酸，survivin蛋白N-端的桿狀病毒細胞凋亡抑制蛋白重復(fù)序列（BIR）結(jié)構(gòu)域可以通過抑制procaspase-3和procaspase-7或直接抑制激活的caspase-3和caspase-7的活性來發(fā)揮抑制凋亡的作用。

本實驗采用大鼠SCII模型，在缺血損傷30min，再灌注損傷后6h、24h時觀察人參皂苷Rg1神經(jīng)細胞形態(tài)、Bcl-2及survinin表達水平。結(jié)果顯示，與再灌注組比較，藥物組在再灌注損傷6h、24h時神經(jīng)細胞的變性、皺縮、脊髓組織中空泡形成等病理變化明顯減輕；而神經(jīng)元胞體內(nèi)Bcl-2及survivin表達水平，顯著高于其他各組。以上結(jié)果提示，通過上調(diào)Bcl-2及survinin的表達，穩(wěn)定線粒體膜，減少細胞色素C、AIF等的釋放，抑制precaspases家族的激活，可能是人參皂苷Rg1發(fā)揮抗凋亡作用的機制之一。

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Effect of Ginsenoside Rg1 on Apoptosis after Spinal Cord Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LI Feng-tao1，LIN Lei2，CHENG Bin1

1.Department of Orthopedics，the 2nd Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shaanxi 710004，China；2.Department of Orthopedics，the Hanzhong Central Hospital，Hanzhong，Shaanxi 723000，China

Correspondence to CHENG Bin.E-mail：drcheng2006@sina.com

Abstract：Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1 on apoptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury（SCII）in rats.Methods Forty-eight adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group（n=8），ischemia group（n=8），ischemia-reperfusion group（n=16）and drug group（n=16）.Fogarty catheter was put in the thoracic aorta of the rats and the blood flow wasn't blocked in the sham group.The rats in the ischemia group were sacrificed 30 minutes after spinal cord ischemia.The drug group was injected with ginsenoside Rg1 30mg/kg 30 minutes before and after SCII.The same volume of normal saline was injected in the ischemia-reperfusion group at the same time.The expression of Bcl-2 and survivin was detected with immunohistochemistry at six hours，24 hours after reperfusion in the ischemia-reperfusion group and drug group，30 minutes after ischemia in the ischemia group and in the sham group.The change of cells was observed in each group with HE staining.Results The cells were damaged in the ischemia group，the ischemia-reperfusion group and the drug group，in which the drug group was better than the other groups.The expression of survivin and Bcl-2 was higher in the ischemia group，the ischemia-reperfusion group and the drug group than in the sham group（t＞3.896，P＜0.01），and were significantly higher six hours and 24 hours after reperfusion in the drug group than in the reperfusion group（t＞6.693，P＜0.001）.Conclusion Ginsenoside Rg1 can reduce the neurons damage and increase the expression of the Bcl-2 and survivin，that inhibit cells apoptosis after SCII in rats.

Key words：spinal cord injury；ischemia-reperfusion injury；ginsenoside Rg1；apoptosis；rats

［中圖分類號］R743.3

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）06-0650-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.006

基金項目：陜西省自然科學(xué)基金面上項目（No.2014JM2_8157）。

作者單位：1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西西安市710004；2.漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中市723000。

作者簡介：李鋒濤（1980-），男，漢族，陜西興平市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：脊柱外科。通訊作者：程斌（1961-），男，漢族，陜西興平市人，博士，教授，主要研究方向：脊柱外科。E-mail：drcheng2006@sina.com。

收稿日期：（2015-11-16修回日期：2016-01-22）